۱۴ زمان طلایی برای نوشیدن آب که نباید از آن‌ها غفلت کنید

بخش زیادی از بدن انسان از آب تشکیل شده است و همه سلول‌های بدن به آب نیاز دارند. آب برای عملکرد دستگاه‌ی گوارش، قلب، ریه‌ها و مغز ضروری است. صرف‌نظر از اینکه بدن به چقدر آب نیاز دارد، نوشیدن آب در بعضی زمان‌های خاص یک حرکت هوشمندانه محسوب می‌شود. با ما در این مقاله همراه باشید تا با بهترین زمان‌ نوشیدن آب آشنا شوید.

بهتر است چه زمانی آب بخوریم؟

نوشیدن آب در موارد زیر اهمیت زیادی دارد:

۱. وقتی فکر می‌کنید گرسنه هستید

گاهی اوقات که احساس گرسنگی می‌کنید، در حقیقت تشنه هستید. چون مغز این محرک‌ها را مثل هم تشخیص می‌دهد. بنابراین بهتر است قبل از اینکه به سراغ غذا بروید، ابتدا مقداری آب بنوشید. سپس چند دقیقه صبر کنید تا ببینید که آیا میل به غذا خوردن برطرف می‌شود یا خیر.

۲. وقتی از خواب بیدار می‌شوید

اول صبح یکی از بهترین زمان‌ها برای نوشیدن آب است. چون بدن شما چند ساعتی است که هیچ نوع غذا و مایعاتی دریافت نکرده و تا حدی کم آب شده است. وقتی از خواب بیدار می‌شوید، به جای قهوه ابتدا یک تا دو لیوان آب بنوشید. این کار به‌خصوص زمانی که باید اول صبح دارو مصرف کنید، اهمیت زیادی دارد.

در ابتدای روز، می‌توانید آب نصف لیموترش را در یک لیوان آب بریزید تا علاوه بر هیدراته کردن بدن مقداری آنتی اکسیدان، ویتامین C و پتاسیم دریافت کنید. بعد از آن می‌توانید به سراغ قهوه‌ی مورد علاقه‌‌ی خود بروید.

۳. هر وقت عرق می‌کنید

هر چیزی که باعث تعریق شما شود (سونا، هوای گرم، ورزش و…)، به از دست دادن مایعات بدن منجر می‌شود. وقتی عضلات گرم می‌شوند، بدن‌ عرق می‌کند تا این گرما را دفع کند. بنابراین، باید آب زیادی بنوشید تا بدن‌تان خنک شود.

۴. قبل، حین و بعد از ورزش کردن

هنگام ورزش برای جایگزین کردن آنچه که از طریق تعریق از دست می‌دهید، به مقدار زیادی آب نیاز دارید. حتی اگر کم‌آبی بدن ناچیز باشد، ممکن است عملکرد شما در طی ورزش تحت تأثیر قرار بگیرد.

اگر ورزش شدید انجام می‌دهید، باید از یکی دو روز قبل از شروع تمرین آبرسانی به بدن را شروع کنید. اگر بخواهید این کار را به ساعت پایانی موکول کنید و دقیقاً قبل از ورزش مقدار زیادی آب بنوشید، دچار مشکلات گوارشی می‌شوید.

برای ورزش با شدت متوسط (مثل دویدن یا پیاده‌روی سریع) باید ۳۰ دقیقه قبل از شروع فعالیت بدنی حدود ۴۸۰ تا ۶۰۰ میلی‌لیتر آب بنوشید و در هنگام ورزش هر ۱۰ تا ۱۵ دقیقه یکبار ۱۸۰ تا ۳۶۰ میلی‌لیتر آب مصرف کنید. پس از اتمام ورزش هم لازم است ۴۸۰ تا ۷۲۰ میلی‌لیتر آب بنوشید.

۵. وقتی بیمار هستید

هنگام بیماری هیدراتاسیون نقش مهمی در درمان شما دارد. مشکلاتی مانند اسهال، استفراغ و تب همگی می‌توانند باعث از دست دادن مقدار زیادی آب شوند. بنابراین به محض اینکه این علائم شروع شدند، مقدار زیادی آب بنوشید. از مصرف نوشیدنی‌های الکلی و نوشیدنی‌های کافئین‌دار بپرهیزید. چون باعث کم ‌آب شدن بدن می‌شوند.

۶. وقتی با هواپیما سفر می‌کنید

آیا تا به حال به این فکر کرده‌اید که چرا هنگام سفر با هواپیما زیاد تشنه می‌شوید؟ همه چیز به ارتفاع ربط دارد. هر چقدر هواپیما بالاتر می‌رود، هوای کابین خشک‌تر می‌شود و تقریباً نیمی از هوای کابین از بیرون به داخل جریان می‌یابد. برای مقابله با رطوبت بسیار کم، یک بطری آب خالی به همراه داشته باشید تا در طول پرواز در صورت نیاز آن را از آب پر کنید.

۷. وقتی ماساژ می‌گیرید

اگر قبل از ماساژ آب بنوشید، عضلات شما نرم‌تر و انعطاف‌پذیرتر می‌شوند و ماساژور راحت‌تر می‌تواند روی آن‌ها کار کند. علاوه بر این، در حین ماساژ موادی در بدن آزاد می‌شوند که باید بعد از اتمام کار با نوشیدن آب فراوان به دفع آن‌ها کمک کنید. این موضوع به‌خصوص زمانی که ماساژهای سنگین می‌گیرید، اهمیت زیادی دارد.

۸. قبل از شروع دوره‌ی قاعدگی

نوشیدن آب قبل از شروع عادت ماهیانه و در حین پریود به کنترل مشکلات قبل از قاعدگی کمک کرده و نفخ را کاهش می‌دهد. یکی از مهم‌ترین دلایل گرفتگی دردناک عضلات یا سردرد، کم‌آبی بدن است. مطالعه روی زنان جوان مبتلا به دیسمنوره (قاعدگی بسیار دردناک) نشان داد که افزایش مصرف آب مدت زمان پریود را کوتاه می‌کند، درد لگن را کاهش می‌دهد و نیاز به داروهای مسکن را کم می‌کند.

۹. وقتی در اواسط روز احساس بی‌حالی می‌کنید

احتمالاً برایتان پیش آمده که در اواسط بعد از ظهر و حدود ساعت سه انرژی‌تان را از دست بدهید. این اتفاق بسیاری از افراد را در ساعات پایانی روز به نوشیدن قهوه ترغیب می‌کند. اما مشکل این است که قهوه ممکن است خواب شما را در طی شب کاهش دهد. تحقیقات نشان می‌دهد که مصرف کافئین حتی ۶ ساعت قبل از غذا می‌تواند خواب را مختل کند. مصرف میان وعده‌های شیرین هم توصیه نمی‌شود. چون بعد از افزایش ناگهانی قند خون باعث افت قند خون و کاهش انرژی بدن می‌شوند.

شواهد نشان می‌دهد که وضعیت هیدراتاسیون بدن به‌طور مستقیم بر خلق و خو، حافظه و ادراک بصری تأثیر می‌گذارد و کم‌آبی بدن علاوه بر خستگی، باعث عصبانیت، سردرگمی و افسردگی می‌شود. وقتی در اواسط روز احساس خستگی و بی‌حالی می‌کنید، یک لیوان بزرگ آب را با لیمو یا سایر طعم‌دهنده‌ها مزه‌دار کرده و بنوشید تا خلق و خوی شما را تقویت کند.

۱۰. وقتی سردرد دارید

یکی از مهم‌ترین محرک‌های میگرن کم‌آبی بدن است. بعضی از افراد گزارش می‌دهند که حتی کاهش جزئی مصرف مایعات می‌تواند به سردرد شدید منجر شود. علاوه بر این، کم‌آبی بدن ممکن است باعث احساس گیجی شود و در بعضی موارد حتی به درمان پزشکی نیاز داشته باشد.

اگر مستعد میگرن هستید، همیشه یک بطری آب در دسترس داشته و مراقب میزان آب مصرفی خود باشید. بهترین زمان نوشیدن آب وقتی است که احساس می‌کنید یک درد شدید در حال وقوع است. در این مواقع نوشیدن یک لیوان آب می‌تواند شما را نجات دهد. افزایش مصرف آب شدت میگرن و دفعات بروز آن را کاهش می‌دهد.

۱۱. قبل از خوردن یک وعده‌ی غذایی

نوشیدن یک لیوان آب قبل از صرف غذا احساس سیری را افزایش داده و از پرخوری جلوگیری می‌کند؛ درنتیجه، می‌تواند به کاهش وزن کمک کند. در یک مطالعه‌ی کوچک، افرادی که قبل از وعده‌ی غذایی ۵۰۰ میلی‌لیتر آب می‌نوشیدند و در طول روز به میزان دلخواه آب دریافت می‌کردند، بررسی شدند. در طی ۱۲ هفته، این افراد تقریباً ۱/۴ کیلوگرم بیشتر از کسانی که از این دستورالعمل پیروی نمی‌کردند، وزن کم کردند.

اگر آبی که می‌نوشید خنک باشد، بهتر است. در یک مطالعه‌ی کوچک که روی گروهی از مردان انجام شد، افرادی که دو لیوان آب خنک با دمای ۳۵ درجه‌ی فارنهایت (۱/۶ درجه‌ی سانتی‌گراد) مصرف کردند، در مقایسه با گروهی که آب گرم یا داغ نوشیدند، غذای کمتری خوردند. چون دمای پایین سرعت هضم غذا را کاهش می‌دهد و به کنترل اشتها کمک می‌کند.

۱۲. وقتی می‌خواهید وزن کم کنید

آب بدون اینکه کالری دریافتی شما را بالا ببرد، باعث افزایش حس سیری می‌شود. اما فواید آن به همین یک مورد محدود نمی‌شود. آب متابولیسم بدن را بالا می‌برد و باعث تسریع لیپولیز (فرآیند چربی‌سوزی بدن برای تولید انرژی) می‌شود.

تکنیک SSCP

تکنیک SSCP

 

 

تكنيكsscp  براي اولين بار در سال 1989 توسط orita و همكارانش براي تعيين جهش‌ها و چند شكلي‌ها به‌كار رفت. عقيده بر اين است كه تعيين موتاسيون‌هاي نقطه‌اي توسط اين تكنيك بر اساس تغيير در ساختار DNA تک‌رشته‌ای استوار مي‌باشد. DNAهای تک‌رشته‌ای كه داراي يك جهش ژنتيكي باشند نسبت به رشته‌هاي نرمال روي ژل پلي‌اكريلاميد الگوي حركتي متفاوتي از خود نشان مي‌دهند (تمام انواع جهش‌هاي نقطه‌اي را مي‌توان با اين روش تشخيص داد). توالي بازهاي كناري باز جهش‌یافته، بر روي قدرت تشخيص اين تكنيك تأثیر مي‌گذارد (شکل 1). يكي از مشكلات اين تكنيك اين است كه بر اساس نوع جهش، نمی‌توان الگوي حركت DNA تک‌رشته‌ای را پیش‌بینی نمود. ميزان توانايي اين روش براي تعيين جهش‌ها در مجموع حدود 70% است، ولي مي‌توان آن را به 95% هم رساند. بيشترين جاذبه اين تكنيك در سادگي آن است. هنگامي كه DNA تک‌رشته‌ای يا دو رشته‌ای روي يك ژل الكتروفورز مي‌شوند، حركت قطعه DNA وابسته به اندازه آن مي‌باشد، اما حركت DNA تک‌رشته‌ای علاوه بر اندازه، تابع شكل فضايي نيز هست كه به علت پيوندهاي هيدروژني داخل زنجیره‌ای در DNA تک‌رشته‌ای است،‌ پس به علت این‌که DNA تک‌رشته‌ای نمی‌تواند به‌صورت يك خط صاف از ژل عبور كند، حركت آن تابع اندازه و ساختار سوم (شكل فضايي) مي‌باشد. اگر يك موتاسيون در يك رشته DNA وجود داشته باشد، بر روي اين شكل فضايي تأثیر مي‌گذارد. بر روي ژل SSCP علاوه بر DNA تک‌رشته‌ای DNA دو رشته‌اي نيز وجود دارد كه به علت چسبيدن مجدد تك رشته‌ها ايجاد شده و سريع‌تر حركت مي‌كند.

شکل ۱: نمای کلی از تکنیک SCCP

 

متغيرهاي ژل SSCP

متأسفانه شكل فضايي يك قطعه DNA تک‌رشته‌ای تابع متغيرهاي ژل نيز هست. حركت يك قطعه DNA تک‌رشته‌ای نه تنها تابع شرايط ژل مي‌باشد، بلكه بين ژل‌هاي مختلف نيز ممكن است کاملاً تكرارپذير نباشد. يك سري از قطعات DNA كه داراي يك توالي هستند، حركت يكساني دارند، ولی اگر جهشي در آنها رخ دهد حركت آن رشته‌ها تفاوت مي‌كند.

حساسيت SSCP وابسته به شرايط زير است:

الف) دماي ژل: در اين تكنيك دماي ژل اهميت اساسي دارد؛ دماي بالا اثر دناتوره كننده دارد و باعث كاهش در ميزان تشكيل ساختار سوم مي‌شود و اين مسئله سبب كاهش توانايي تكنيك در تعيين جهش‌ها مي‌شود. معمولاً براي به حداكثر رساندن ميزان تعيين جهش‌ها، بعضي از محققين نمونه‌ها را در دماي ۴ درجه سلسیوس الكتروفورز مي‌كنند. پس بهتر است نمونه‌ها در يك اتاق با دماي ۴ درجه سلسیوس الكتروفورز شود. برای این منظور مي‌توان از يك دستگاه خنک‌کننده ژل استفاده کرد.

تکنیک SSCP

ب) غلظت ماده Cross-linker و اكريلاميد: ژل پلي‌اكريلاميد از پليمريزاسيون اكريلاميد و يك ماده Cross-linker به‌وجود مي‌آيد كه معمولاً N,N^/-Methylene bis acrylamide است. اندازه منافذ ژل تحت تأثیر غلظت ژل (T%) و نيز ميزان ماده Cross-linker‌ (C%) مي‌باشد.

فرمول ۱ محاسبه غلظت ژل پلي‌اكريلاميد:

فرمول ۲ محاسبه درصد ماده Cross-linker:

بیشتر بدانید:شیشه الات ازمایشگاهی

معمولاً براي SSCP، C% حدود 2 و T% بين 10-6% بهترين نتيجه را مي‌دهد، هم‌چنین معمولاً براي SSCP درصد اكريلاميد بيشتر در حدود  6-5% استفاده مي‌شود، هرچند بعضي گروه‌های تحقيقاتي ژل‌هاي تا حدود 10% را نيز به‌كار مي‌برند.

تکنیک SSCP

ج) گليسرول: معمولاً به ژل‌هاي SSCP گليسرول اضافه مي‌شود. نشان داده شده است كه درصد گلیسرول بين10-5% توانايي SSCP را در تشخيص جهش‌ها بالا مي‌برد. اثر گليسرول را به‌علت داشتن گروه‌هاي –OH مي‌دانند كه باعث Relaxation قطعات DNA تک‌رشته‌ای مي‌شود.

 

د) نوع ماتريكس ژل: ژل‌ (Mutation Detection Enhancement) MDE، يك ژل تجاري است كه مزايايي را نسبت به ژل پلي‌اكريلاميد معمولي در نشان دادن تغييرات حركتي كوچك باندها دارا مي‌باشد. اين ژل بيشتر در Heteroduplex Analysis (HA) به‌كار مي‌رود.

ه ) طول قطعه مورد بررسي: پارامتر كليدي ديگر كه بر ميزان تعيين جهش‌ها توسط اين تكنيك اثر مي‌گذارد، طول قطعه اسيد نوكلئيكي است كه مورد ارزيابي قرار مي‌گيرد. عموماً هر چه قطعه مورد نظر بزرگتر باشد، حساسيت اين تكنيك پائين‌تر مي‌آيد، اما يك نقطه واضح و مشخص وجود ندارد، بلكه يك كاهش تدريجي در حساسيت تكنيك با افزايش طول قطعه DNA از bp250 به بالا وجود دارد. عموماً 300 باز را حد بالاي طول قطعه در نظر مي‌گيرند، اما بعضي مقالات و مراجع تا bp450 را هم ذكر كرده‌اند. همچنين محل بروز موتاسيون نيز در حساسيت شناسايي آن مؤثر است. براي به‌دست آوردن طول قطعاتي كه متناسب براي SSCP باشند، مي‌توان به گونه‌اي طراحي كرد كه قطعات حاصل از PCR را زير bp300 به‌دست آورد يا اینکه ابتدا يك قطعه بزرگ را تكثير كرده و سپس به‌وسیله هضم آنزيمي آن را به قطعات كوچك‌تر تقسيم نمود.

امروزه پيشرفت‌هاي زيادي در اين تكنيك به عمل آمده است، به‌عنوان مثال از پرايمرهاي نشاندار شده با فلوئورسين براي تكثير استفاده شده و قطعات روي دستگاه Sequencer به‌طور اتوماتيك آناليز مي‌شوند. همچنين اين تكنيك به‌صورت Multiplex در تعيين جهش‌هاي ژنتيكي در چندين ژن از جمله ديستروفين به كار رفته است.

اين تكنيك در تعيين جهش‌ بسياري از بيماري‌ها به كار رفته است، از جمله تعيين جهش‌هاي ژنتيكي در بيماري تي-ساكس، لوكوس ژن P53، ژن فيبروزیس سيستيك، ژن گيرنده انسولين، ژن گلوكوكيناز، ژنوم ميتوكندري و هموفيلي B.

در مورد حساسيت اين روش عقيده بر اين است كه براي يك قطعه ۲۰۰-۱۰۰ بازي بين ۹۵-۵۰% جهش‌ها را مي‌توان به دست آورد و با شرايط مختلف اين حساسيت ممكن است به ۱۰۰% برسد، ولي متأسفانه روشي براي پیش‌بینی اين شرايط وجود ندارد. در جدول زير مزايا و معايب اين تكنيك آورده شده است:

تکنیک SSCP

جدول ۱: مزايا و معايب تکنیک SCCP

مزايا	معايب
الف)‌ سادگي و كم بودن مراحل انجام آنب)تئوري پيچيده‌اي ندارد. ج) به تجهيزات اختصاصي نياز نيست. د) مي‌توان بدون نشاندار كردن آن را انجام داد.	الف) محل جهش ناشناخته باقي مي‌ماند.ب) محدوديت در اندازه قطعات مورد بررسي وجود دارد. ج) به‌شدت وابسته به شرايط آزمايشگاهي است. د) جهش‌ها ممكن است ناشناخته باقي بماند (به علت حساسيت محدود) ه) گاهي تفسير ژل‌ها مشكل می‌باشد.

تکنیک SSCP

روش كار تکنیک SCCP:

همانطور که در بالا اشاره شد این تکنیک يكي از ساده‌ترين تكنيك‌هاي غربالگري جهش بوده و به ابزار پيچيده‌اي نياز ندارد. در اين روش تحت شرايط ويژه‌اي اسيد نوكلئيك تک‌رشته‌ای، ساختمان ثانويه‌اي را در محلول تشكيل مي‌دهد. اين ساختار ثانويه بستگي به تركيب بافرها دارد و ممكن است با تغيير يك نوكلئوتيد عوض شود و اين مسئله باعث تفاوت در الگوی حركت الكتروفورتیک قطعات در شرايط non denaturing روي ژل مي‌شود. مشاهده شده است كه ساختمان ثانويه توسط RNA بهتر از DNA تشكيل مي‌شود. همچنين به‌وسیله RNA-SSCP قطعات بزرگ‌تري را مي‌توان آناليز كرد. براي تأیيد جهش‌های شناسایی شده توسط SSCP بايد تعيين توالي نیز انجام شود، زيرا چندشکلی‌ها هم مي‌توانند سبب تغييرات حركتي در SSCP شوند.

يكي از مشكلات بزرگ SSCP تجربي بودن آن است. مشكل ديگر اندازه قطعاتي است كه بررسي مي‌شوند كه در حدود 300-200 باز، بهترين اندازه گزارش شده است. اگرچه اين تكنيك سريع و ساده است، اما حساسيت اين روش در دست افراد مختلف متفاوت بوده و مسائل دخيل در آن به‌خوبی شناخته نشده است. گروه‌هاي مختلفي بر روي پارامترهاي مؤثر بر SSCP تحقيق كرده‌اند.

به‌طورکلی پارامترهاي زير مي‌توانند بر روي الگوي جدا شدن تك‌رشته‌ها تأثیر بگذارند:

۱) حرارت

۲) افزودن‌ مواد دناتوره كننده به ژل (اوره- فرماميد)

3) افزودن مواد خنثي (neutral)

۴) تغيير اندازه منافذ ژل

۵) غلظت اكريلاميد

Glavac و Dean با مقايسه تغييرات حركت در تعدادي از جهش‌ها روي ژل اكريلاميد 5% در غلظت C حدود 2/6% به نتايج جالبي رسيده‌اند؛ آن‌ها مشاهده كردند كه رشته‌هاي غني از بازهاي پوريني داراي جهش، تغييرات حركتي بيشتري را نسبت به رشته‌هاي غني از پيريميدين نشان مي‌دهند. از سوي ديگر بر روي ژل 7/5% در همان غلظت ماده Cross-linker مشاهده كردند كه تغيير حركت بيشتر در رشته‌هاي غني از پيريميدين ديده مي‌شوند. ازآنجایی‌که اندازه منافذ ژل تحت تأثیر غلظت اكريلاميد و درصد ماده Cross-linker مي‌باشد، به‌نظر مي‌رسد كه نه تنها اندازه منافذ، بلكه ساختمان ژل نيز روي حركت DNAهاي تک‌رشته‌ای تأثیر مي‌گذارد. ممكن است استفاده از شيب اندازه منافذ مؤثر باشد.

افزودن 10-5% از تركيبات خنثي به ژل اثرات متفاوتي روي الگوي حركت رشته‌ها در SSCP دارد. بعضي از اين مواد نظير بوتانل 10% اثري ندارند و بعضي نظير اوره 5% يا فرماميد 5% اثر ناچيزي دارند، اما موادي مانند گليسرول، گلوكز و سوكروز اثرات خوبي روي حركت تک‌رشته‌ای‌ها دارند. اين امر نشان‌دهنده اين است كه اين تركيبات با مكانيسم مشابهي روي ساختمان سنجاق‌سری در تك‌رشته‌ها اثر مي‌گذارند. اين اثر ممكن است به علت واكنش خفيف گروه‌هاي OH و يا تشكيل باندهاي هيدروژني داخل مولكولي باشد.

در حال حاضر نمي‌توان تغيير حركتي را كه به‌وسیله تغييرات در يك باز ايجاد مي‌شود پيش‌بيني نمود. به نظر مي‌رسد كه در اكثر موارد بازهاي مجاور محل جهش، اثر مهم‌تری روي تغييرات حركتي DNA تک‌رشته‌ای داشته باشند. مي‌توان از اين مسئله این‌طور نتيجه‌گيري كرد كه كارايي SSCP تا حد زيادي به توالي مورد آزمايش بستگي دارد و اين ميزان كارايي از يك قطعه DNA به قطعه ديگر متفاوت است.

عامل ديگر، اندازه قطعه DNA مورد نظر است كه هر چه بزرگ‌تر باشد امكان این‌که يك تفاوت باز منجر به القاء تغيير ساختمان و تغییر حرکت روي ژل شود، كمتر مي‌گردد.

درنهایت به‌نظر مي‌رسد كه مهم‌ترین متغيرهاي مؤثر بر SSCP علاوه بر اندازه قطعه مورد بررسي، غلظت ژل و ماده Cross-linker مي‌باشد. حساسيت اين روش در ژل‌هاي با غلظت اكريلاميد بين 10-8% و ماده Cross-linker بين 2/6-1/3% به حداكثر خود مي‌رسد. تحت اين شرايط مي‌توان چندشکلی قطعات بين 200-120 باز را با حداكثر حساسيت به دست آورد. به نظر مي‌رسد كه يك ژل بهينه براي SSCP در شروع كار، اكريلاميد 8% با ماده Cross-linker 2% كه در 4 درجه سلسیوس الكتروفورز شود، مي‌باشد.

درنهایت نكته‌اي كه در مورد SSCP مي‌توان گفت اين است كه با وجودي كه SSCP يك تكنيك با تكنولوژي بالا نيست، اما همچنان شايع‌ترين روش براي بررسي جهش‌های ناشناخته می‌باشد.

تکنیک SSCP

تهيه ژل پلي‌اكريلاميد:

مواد و دستگاه‌ها

1. پلي اكريلاميد/ بيس اكريلاميد (۱/۳۹)
2. TBE 10X
3. گليسرول
4. آب ديونيزه
5. آمونيم پرسولفات (APS) 10%(W/V)
6. TEMED
7. Bind Saline A174
8. اسيد استيك ۱۰%
9. اتانول ۹۶%
10. سيستم كامل الكتروفورز
11. Circulator 230 VAC
12. NaOH 0.5M

تکنیک SSCP

روش كار:

ابتدا شيشه‌هاي الكتروفورز را به مدت يك شب در NaOH 0.5M قرار داده و پس از شستشو با آب مقطر، با الكل 96% تيمار مي‌شوند. براي چسباندن ژل پلي‌اكريلاميد به شيشه صاف زيرين، محلول زير تهيه شود:

۱ ميلي‌ليتر اتانول ۹۶%

lµ 250 اسيد استيك 10%

lµ 3/5 Bind Saline

پس از مخلوط كردن، اين محلول را روي شيشه صاف ريخته و در تمام قسمت‌هاي آن به‌طور كامل پخش كنيد.

1. پس از قرار دادن Spacerها روي شيشه زيرين، شيشه لبه‌دار را روي آن قرار داده و با Binder محكم كنيد.
2. ژل پلي‌اكريلاميد را به‌صورت زير آماده نمایید:

 

2ml	TBE 10X
۵-۱۰%	Glycerol
۶-۱۰%	Acr/Bis 39/1
lµ400	APS 10%
lµ40	TEMED

 

سپس آب ديونيزه اضافه شده تا حجم محلول به ۴۰ سي‌سي برسد.

پس از تهيه، تركيب فوق را به‌آرامی بين دو لايه شيشه ريخته و شانه را قرار دهيد. بعد از حدود يك ساعت ژل تشكيل مي‌شود. پس از بستن ژل شيشه را بر روي تانك عمودي قرار داده و به مدت 15 دقيقه براي رسيدن به تعادل حرارتي و الكتريكي pre run شود.

 

آماده‌سازی نمونه‌ها و الكتروفورز:

lµ5 از محصول PCR را با lµ12 از بافر بارگذاري SSCP مخلوط نموده و به مدت 5 دقيقه در حرارت 95 درجه سلسیوس قرار دهيد. سپس به‌سرعت نمونه را به درون يخ منتقل نماييد.

تركيب بافر بارگذاري عبارت است از: گزيلن، فرماميد 95%، NaOH 1Mm، برومو فنل بلو %0/05 و سيانول %0/05

نمونه‌ها را درون چاهك‌هاي تعبيه شده بر روي ژل قرار دهيد و با ولتاژ ۱۰۰۰-۸۰۰ و در حرارت ۴ درجه سلسیوس به مدت ۶ ساعت الكتروفورز نماييد.

 

رنگ‌آميزي نيترات نقره:

براي ارزيابي ژل‌هاي پلي‌اكريلاميد از رنگ نيترات نقره استفاده مي‌شود. اين روش معمولاً زمان‌بر مي‌باشد. به همين دليل از يك پروتكل ساده‌تر استفاده مي‌شود.

 

مواد مورد نياز رنگ‌آميزي:

اسيد نيتريك ۱۰%

نيترات نقره 0/2%(W/V)+ 0/5ميلي‌ليتر فرماميد 37% تازه

NaCO323% (W/V)+ 0/5 ميلي‌ليتر فرماميد 37%+0/5 ميلي‌ليتر تيوسولفات 2%

اسيد استيك ۱۰%(محلول متوقف كننده)

 

روش رنگ‌آميزي:

1. پس از اتمام الكتروفورز دو شيشه را از هم باز نموده و شيشة حاوي ژل را در سيني قرار دهيد و با آب ديونيزه شستشو دهيد.
2. به ژل اسيد نيتريك ۱% افزوده و ۵ دقيقه به‌آرامی تكان دهيد.
3. اسيد نيتريك را تخليه و ژل را به مدت ۲ دقيقه با آب ديونيزه شستشو دهيد.
4. پس از تخليه آب، محلول نيترات نقره را به ژل اضافه نموده و ۱۵ دقيقه در تاريكي تکان دهید (به‌منظور جلوگيري از اكسيداسيون و تیره شدن)
5. ژل را با آب شستشو دهيد.
6. محلول حاوي NaCO3 را روي ژل ريخته و تا ظاهر شدن باند Shake نماييد.
7. پس از ظاهر شدن باندها به ژل اسيد استيك ۱۰% افزوده تا واكنش متوقف شود.
8. درنهایت ژل را با آب مقطر شستشو داده و از آن عکس تهیه نمایید.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

 

تجهیزات سنجش مایعات؛ سانتریفیوژ و رفراکتومتری

 

سانتريفیوژ

سانتريفیوژ – Centrifuge وسیله‌ای است جهت سرعت بخشيدن به جدا شدن ذراتي كه وزن‌های متفاوت دارند. اساس و مبناي اين جداسازي مبتني بر اثر نيروي جاذبه زمين است. در اين روش جداسازي، ذرات براساس حركت چرخشي كه سانتريفیوژ انجام می‌دهد، شتاب گرفته و تحت نيروي وزنشان ته‌نشین می‌شوند. عمدتاً اين ذرات به‌صورت محلول می‌باشند، گرچه امروزه سانتريفیوژ روي ذرات گازي نيز انجام می‌گیرد. به‌طور كلي در عمل سانتريفیوژ، ذرات تحت تأثير دو نيرو يكي نيروي جاذبه يا وزنشان و ديگري نيروي حاصل از سانتريفیوژ خواهند بود. چون ذرات، كروي می‌باشند، بنابراين آنها مطابق قانون استوک– Stokes’s Law ته‌نشین می‌شوند كه سرعت ته‌نشین شدن ذرات برابر است با:

که در رابطه فوق، V، سرعت جداشدن ذرات، ، ویسکوزیته محیط، ، نیرویی که بر ذره اعمال می‌شود، r، شعاع ذرات کروی، ، دانسیته خود ذره و  دانسیته محلول یا محیط می‌باشد که ذرات در آن قرار دارند.

بر اساس اين رابطه، هر چه شعاع ذرات بيشتر و دانسيته خود ذرات نيز بيشتر باشد، سرعت جدا شدن ذرات بيشتر خواهد شد، اما در اين رابطه، ويسكوزيته محيط رابطه عكس با سرعت جدا شدن ذرات دارد، بنابراين هرچه محيط روان‌تر باشد، يعني محيط مایع‌تر باشد، باز هم سرعت جدا شدن ذرات بيشتر خواهد شد. در رابطه فوق همان نيرويي است كه بر ذره اعمال می‌شود و باعث می‌شود ذره شتابي بگيرد كه وابسته به نيروي جاذبه است و مقدار آن برابر است با:

که در این رابطه،  سرعت زاویه‌ای ذرات و  شعاع از مرکز دوران می‌باشد. پس يك حركت دوراني با سرعت زاویه‌ای بزرگ‌تر يا با مسير حركت دایره‌ای بيشتر، داراي مقدار شتاب بزرگ‌تری خواهد بود.

آهنگ (تغييرات برحسب واحد زمان) ته‌نشین شدن ذرات با ضريبي به نام ضريب اسوِدبرگ– Svedberg نمايش داده می‌شود. اين ضريب با S نشان داده شده و مقدار آن در ميدان حاصل از سانتريفیوژ عبارت است از:

  

همانطورکه در رابطه فوق مشاهده می‌شود، مقدار همان شتاب زاویه‌ای می‌باشد و مقداري ثابت است كه ديفرانسيل يا مشتق بر روي آن اثر ندارد، بنابراين اين آهنگ ته‌نشین شدن ذرات، براساس فاصله يا شعاع از مركز دوران تغيير می‌کند.

 

نیروی نسبی گریز از مرکز

نیروی نسبی گریز از مرکز یا RCF (Relative Centrifugal Force) که به شعاع و سرعت دوران بستگی دارد از طریق رابطه زیر محاسبه می‌شود:

RCF = 1.118 × ۱۰^-۶ × r × (rpm)^۲

که در این رابطه:

r، شعاع سانتریفیوژ برحسب میلی‌متر است. لازم به ذکر است که مقدار شعاع، از محور یا مرکز چرخش سانتریفیوژ تا انتهای لوله درون این دستگاه اندازه‌گیری می‌شود.

rpm، سرعت چرخش برحسب دور در دقیقه

۱.۱۱۸ × ۱۰^-۶، مقداری تجربی و قراردادی است.

واحد RCF بر اساس ضریبی از g بیان می‌شود.

برای مثال، اگر شعاع چرخش، 7/5 سانتیمتر و سرعت چرخش سانتریفیوژ 2500 rpm باشد، RCF حدود 500 g خواهد شد؛ به عبارت بهتر ذرات معلق در محلول، در سرعت 2500 rpm حدود 500 بار سریع‌تر از حالت عادی ته‌نشین می‌شوند.

همانطور که مشخص است، رابطه فوق را می‌توان به فرم زیر هم نوشت:

که این رابطه برای تعیین سرعت (rpm) برای RCF معلوم (مثلاً 2000g) کمک‌کننده است.

گاهی RCF تولیدشده دستگاه حتی با حداکثر دور هم کافی نیست، در این موارد با اضافه کردن زمان، جبران می‌کنیم.

RCF را می‌توان به‌وسیله نموگرام نیز تعیین نمود (شکل 1).

در این حالت با رسم خطی که از شعاع سانتریفیوژ و gیِ مورد انتظار عبور می‌کند و ادامه آن، سرعت به دست می‌آید، به‌عنوان مثال در شکل زیر برای بدست آوردن نیروی 500g در سانتریفیوژی که شعاع آن 75 میلی‌متر است، لازم است سرعت روی 2500 دور در دقیقه تنظیم گردد.

شکل ۱: نموگرام مورد استفاده در تعیین میزان RCF

 

اجزاء سانتریفیوژ

1. سر سانتریفوژ: شامل ضمائمی مانند فنجانک (Bucket) می‌باشد که محل قرار گرفتن لوله‌های آزمایش است.
2. مفصل نگهدارنده (Trunion): عضوی است که فنجانک‌ها درون آن قرار می‌گیرند.
3. موتور: سر سانتریفیوژ بر روی آن قرار گرفته و همزمان با گردش موتور می‌چرخد. موتورهای مورد استفاده یا با برق مستقیم AC و یا با برق DC کار می‌کنند.
4. کلید (Switch): برای خاموش و روشن کردن دستگاه بکار می‌رود.
5. زمان‌سنج (Timer): برای تنظیم مدت زمان سانتریفیوژ نمونه استفاده می‌شود و در دو نوع آنالوگ و دیجیتال ساخته شده‌اند.
6. پتانسیومتر (Potentiometer): برای تنظیم دور موتور و کنترل سرعت چرخش آن استفاده می‌شود. پتانسیومترها در دو نوع آنالوگ و دیجیتال در دسترس می‌باشند.
7. ترمز: ابزاری است که پس از اتمام مدت زمان سانتریفیوژ و یا در مواقع ضروری جهت توقف حرکت موتور سانتریفیوژ استفاده می‌شود. این وسیله می‌تواند مکانیکی و یا الکترونیکی باشد. در نوع الکترونیکی با تغییر پولاریتی جریان برق موتور موجب توقف آن می‌شود.
8. سرعت‌سنج: برای نمایش سرعت موتور برحسب rpm
9. محور چرخان (روتور): انواع مختلف محور چرخان وجود دارد؛ انواع متداول آن زاویة ثابت، شناور، لوله‌های عمودی هستند که شرح آنها به‌قرار زیر است:

• محور چرخان با زاویه ثابت: كاربري عمومي دارد. در اين نوع سانتريفیوژها، لوله‌ها، زاوية ثابت (۲۰ تا ۴۵ درجه) نسبت به محور سانتريفیوژ دارند. کاربرد اين سانتريفیوژها عمدتاً در ايجاد سديمان‍هاي سلولي (رسوب سلولی) است. زاویه‌دار بودن سبب می‌شود مسير حرکت ذرات کوتاه‌تر شده و زمان سانتريفیوژ آنها در مقايسه با محور چرخان با سبد شناور کمتر شود.
• محور چرخان با سبد شناور: اين محور چرخان در انجام مطالعات براساس چگالي ذرات (Isopycnic Studies) و مطالعاتي که سرعت حرکت ذرات براساس اندازه آنها است، کاربرد دارد. در این مطالعات تشکيل لایه‌های متعدد در طول لوله مشاهده می‌شود.
• محور چرخان با لوله‌های عمودي: در اين نوع محور در زمان چرخش، لوله‌های نمونه در حالت عمودي قرار دارند. از اين نوع محورهای چرخان براي مطالعات براساس چگالي ذرات و وقتی‌که زمان کوتاه سانتريفیوژ شدن عامل مهمی در تشکيل لایه‌ها است، استفاده می‌شود.
• محور چرخان با لوله‌های تقریباً عمودي: اين نوع محورهاي چرخان براي جداسازی نمونه‌هایی که در آنها ته‌نشینی ذرات براساس چگالي يا اندازه نيست، طراحي شده‌‍‌اند. زاويه كوچك در این نوع محورها زمان سانتریفیوژ شدن را در مقایسه با محور چرخان با زاویه ثابت كم می‌کند.

 

انواع سانتريفیوژها

تقسیم‌بندی انواع سانتريفیوژها براساس تعداد دور در دقيقه و همچنين نحوه قرار گرفتن محور سانتريفیوژ تا محور دوران می‌باشد. به‌طور كلي و بر اين اساس سانتريفیوژها به دو دسته تقسيم خواهند شد:

سانتريفیوژ افقي: در اين نوع سانتريفیوژ، لوله آزمايش، موازي شعاع مركز دوران می‌باشد، درواقع اين نوع سانتريفیوژ، زاویه‌دار نيست و هنگام جداسازي، رسوب ته‌نشین‌شده موازي با محور خود سانتريفیوژ است (شکل ۲).

شکل ۲: روتور یک نمونه سانتریفیوژ افقی

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

سانتريفیوژ با زاويه ثابت–Fixed angle : در اين نوع سانتريفیوژ، معمولاً زاويه چرخش نسبت به سطح عمود ۲۵ يا ۴۵ درجه است و تحت اين شرايط، سانتريفیوژ عمل جداسازي را انجام می‌دهد و ذرات تحت تأثير دو نيروي وزن خود و همچنين نيروي جانب مركز سانتريفیوژ جدا می‌شوند كه اغلب اين نوع رسوب ناپايدار است (شکل ۳). بعضي اوقات اين نوع سانتريفیوژ ممكن است دورهاي بسيار بالايي را داشته باشد و در اين صورت، به آن، سانتريفیوژ با سرعت بالا يا اولتراسانتريفیوژ گويند. اولتراسانتريفوژ می‌تواند سرعتي در حدود ۱۰۰۰۰۰ دور در دقيقه داشته باشد كه از آن در كارهاي دقیق‌تر و تحقيقاتي و پژوهشي از جمله جدا نمودن اسيدهاي آمينه مختلف يك تركيب پروتئيني و يا عناصر ساختماني سلول (ساختمان مولكولي سلول) و همچنين در جداسازي و تفكيك انواع مختلف لیپوپروتئین‌های سرم از يكديگر استفاده می‌شود (شکل ۴). از ديدگاهي ديگر، تقسیم‌بندی سانتريفیوژها برحسب سرعت تعداد دوران آنهاست، يعني سانتريفیوژهاي با دور پايين ۲۰۰۰ تا ۸۰۰۰، سانتريفوژهاي با دور بالا ۲۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰۰ و اولتراسانتريفیوژها با دور ۷۵۰۰۰ تا ۱۲۰۰۰۰. امكانات اولتراسانتريفیوژها از دو دستگاه ديگر بيشتر است، تمامي مدل‌های اولتراسانتريفیوژ، داراي يخچال سيستم خلأ و شتاب‌دهنده هستند.

شکل ۳: نمونه‌ای از روتور سانتریفیوژ Fixed angle

شکل ۴: نمونه‌ای از سانتريفیوژ با سرعت بالا يا اولتراسانتريفیوژ

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

در طی سانتریفیوژ به علت حرکت موتور دستگاه، حرارت تولید می‌شود و به ازای هر 10 دقیقه سانتریفیوژ، دمای داخل آن تا 5 درجه سانتی‌گراد بالا می‌رود. ایجاد حرارت بستگی به تعداد دور در دقیقه (rpm)، زمان چرخش و طرح روتور یا قسمت چرخنده دارد. این افزایش حرارت باعث همولیز و تبخیر نمونه یا محلول‌ها می‌شود. برای سانتریفیوژ کردن موادی که نسبت به افزایش دما حساس هستند توصیه می‌شود از سانتریفیوژهای یخچال‌دار استفاده گردد. سانتریفیوژهای یخچال‌دار که دارای سرعتی بین 6000 تا 20000 دور در دقیقه هستند بیشتر برای جداسازی موادی به کار می‌روند که نسبت به حرارت حساس هستند.

در یک تقسیم‌بندی دیگر، می‌توان به برخی از سانتریفیوژهایی که در آزمایشگاه‌ها موجودند اشاره کرد:

 

۱: سانتریفیوژ سایتولوژی

از این نوع سانتریفیوژ برای قرار دادن سلول‌های موجود در یک مایع روی اسلاید میکروسکوپ استفاده می‌شود. در موقع استفاده، کاربر ظرف مخصوص نمونه، صفحه فیلتر و یک اسلاید را کنار هم قرار می‌دهد. سپس همگی را در داخل روتور گذاشته، مایع موردنظر را در ظرف مخصوص نمونه قرار داده و دستگاه را روشن می‌کند. بعد از فعال شدن دستگاه، مایع با فشار در تماس با مجموعه فیلتر و اسلاید قرار می‌گیرد (شکل ۵).

شکل ۵: سانتریفیوژ سایتولوژی

 بیشتر بدانید:شیشه الات ازمایشگاهی

۲: سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

این سانتریفیوژها (شکل 6) که برای تعیین میزان هماتوکریت خون استفاده می‌شوند دارای روتوری می‌باشند که لوله‌های حاوی نمونه به‌صورت افقی روی آن قرار می‌گیرند (شکل 7). بعد از انجام سانتریفیوژ با استفاده از یک صفحه درجه‌بندی‌شده، مقدار هماتوکریت بدست می‌آید. براساس استانداردهای NCCLS (سازمان استانداردهای آزمایشگاه)، RCF سانتریفیوژ میکروهماتوکریت حداقل 10000g و زمان سانتریفیوژ 3 تا 5 دقیقه است. این دستگاه‌ها دارای سرعت بالایی تا حدود 20000 دور در دقیقه می‌باشند.

شکل ۶: سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

 

شکل ۷: روتور سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

۳: میکروسانتریفیوژها

از این نوع سانتریفیوژها برای نمونه‌های با حجم کم (غالباً کمتر از 1.5ml) مانند نمونه‌های گرفته‌شده از اطفال استفاده می‌شود. میکروسانتریفیوژها (شکل 8) در مدل‌های با دور بالا و پایین ساخته می‌شوند. در دور پایین حداکثر سرعت 13000 دور در دقیقه بوده و برای خون و سایر محصولات خونی کاربرد دارد. در مدل‌های با دور بالا حداکثر سرعت به 28000 دور در دقیقه نیز می‌رسد و برای جمع‌آوری سلول‌ها و میکروارگانیسم‌ها و بررسی ارگانل‌های سلولی کاربرد دارند.

شکل ۸: نمونه‌ای از یک میکروسانتریفیوژ

 

۴: سانتریفیوژهای شستشو دهنده سلول

از این نوع سانتریفیوژ جهت شستشو، دکانته کردن، مخلوط کردن و شستشوی مجدد یاخته‌های قرمز خون قبل از آزمایش‌های متعددی چون Antiglobulin استفاده می‌شود (شکل 9).

شکل ۹: سانتریفیوژهای شستشو دهنده سلول

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

کار با سانتریفیوژ

روش کار این دستگاه به‌صورت زیر است:

1. لوله‌ای که برای گذاشتن در سانتریفیوژ استفاده می‌کنید باید تحمل RCF موردنظر را داشته باشد. لوله‌های سانتريفيوژ لوله‌های باريك و مخروطي شكلي هستند كه اندازه‌های متفاوتي دارند و از شيشه يا پلاستيك ساخته شده‌اند. ظرفيت آنها از ده‌ها میلی‌متر تا ظرفیت‌های بسيار كمتر براي ميكروسانتريفيوژهاي مورد استفاده در آزمایشگاه‌های بيولوژي مولكولي تغيير می‌کند. رایج‌ترین لوله‌ها از نظر شكل و اندازه، مشابه يك لوله تست معمولي (با طول تقریباً 10 سانتيمتر) هستند. ميكروسانتيريفيوژها معمولاً لوله‌های ميكروسانتريفيوژ با ظرفیت‌های بين 250 ميكروليتر تا 2 میلی‌لیتر را قبول می‌کنند كه اغلب از پلاستيك ساخته شده‌اند. لوله‌های سانتريفيوژ ساخته‌شده از شيشه مي‌توانند با اغلب حلال‌ها استفاده شوند اما گران‌تر هستند. آن‌ها را می‌توان مانند ديگر وسايل شیشه‌ای آزمايشگاه تميز و با اتوكلاو، استريل كرد. لوله‌های سانتريفيوژ پلاستيكي به‌ویژه لوله‌های ميكروسانتريفيوژ قيمت كمتري دارند. تميز كردن كامل آن‌ها مشكل است و معمولاً قيمت آن‌ها آن‌قدر كم است كه بتوان آن‌ها را يك بار مصرف در نظر گرفت.
2. ابتدا لوله‌ها را از نظر ترک یا شکستگی چک کنید. از سانتریفیوژ کردن این قبیل لوله‌ها خودداری کنید.
3. لوله‌ها را به‌صورت برابر و متقارن در سانتریفیوژ قرار دهید؛ به‌طوریکه با هم بالانس باشند. در صورت عدم تعادل، محور چرخان باعث ارتعاش، سایش سانتریفیوژ و شکستن لوله‌ها می‌شود (می‌توان از پر کردن لوله با آب جهت تعادل طرف مقابل استفاده کرد). اگر در موقع سانتریفیوژ، بالانس رعایت نشود، لرزش یا Vibration رسوب را بهم می‌زند. لرزش زیاد، لوله‌های سانتریفیوژ را می‌شکند. در اثر شکستن لوله در دستگاه، با هر چرخش موتور، آلودگی پخش می‌شود.
4. در سانتریفیوژ را محکم ببندید و کلید روشن/ خاموش را بزنید. مطمئن شوید که در قفل شده است.
5. تایمر را در زمان موردنظر تنظیم کنید و دور را به‌آرامی بچرخانید تا به‌سرعت موردنظر برسد.
6. بعد از توقف کامل سانتریفیوژ، در دستگاه را باز کرده و لوله‌ها را به‌آرامی بیرون بیاورید.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

كاربردهاي سانتريفیوژ

برخي از كاربردهاي سانتريفیوژ و اولتراسانتريفیوژ در علوم پزشكي و بيولوژي به‌طور خلاصه شامل مواردي است كه برخي از آنها در ذيل آورده شده است:

• با استفاده از اولتراسانتريفیوژ می‌توان سلول‌ها، رسوب‌ها، ارگانل‌هاي سلولي، قطعات غشايي، ريبوزوم و پلي‌‍‌‌‌زوم و ماكروملكول‌ها را جداسازي كرد، اما در سانتريفیوژ با دور بالا و معمولي اين امكانات تا حد زيادي محدود شده است، به‌طوری‌که با سانتريفیوژ معمولي می‌توان فقط سلول‌ها را جدا كرد و تنها برخي مدل‌های سانتریفیوژ با دور بالا توانايي جداسازي رسوب‌ها، ارگانل‌ها، قطعات غشايي، ريبوزوم و پلي‌زوم و ماكروملكول‌ها را دارا می‌باشند.
• در بيوشيمي، جهت جدا نمودن پروتئین‌ها از مواد مورد اندازه‌گیری و نيز در آزمایش‌هایی چون اسيد اوريك و كراتينين می‌توان از سانتريفیوژ استفاده نمود.
• در بررسي مطالعات داخل سلولي مثل سنتز پروتئين و كليه فرآيندهاي سوخت‌وساز يا متابوليسم، در مطالعه جریان‌های سلولي مثل سنتز پروتئين يا مثلاً حركت RNA از هسته به سيتوپلاسم و بررسي انواع گیرنده‌های هورموني، در واکنش‌های سلول با سلول و همچنين در علوم تغذيه و بررسي انواع عفونت‌ها از سانتريفیوژ استفاده می‌شود.
• همچنين در بررسي چگونگي تبديل شدن سلول‌ها به سلول‌های سرطاني و جهت جداسازي آنتی‌بادی‌ها مثل ايمنوگلوبين و همچنين ديگر هورمون‌ها، جهت بررسي مؤلفه‌هایی مثل لكوسيت‌ها، بررسي سلول‌های سفيد و قرمز در خون و جهت تجزيه و تحليل برخي مؤلفه‌های پاتولوژيكي نيز از سانتريفیوژها استفاده می‌شود. در پايان، از مزاياي روش سانتريفیوژ، كنترل محيط، يكدست بودن و مشخص بودن نمونه و اقتصادي بودن آن را می‌توان نام برد، همچنين تغييرات ناگهاني شرايط محيط و دشوار بودن كنترل آنها را نيز می‌توان از معايب آن دانست.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

نکات مهم در استفاده از سانتریفیوژ

رعایت نکات زیر تأثیر بسزایی در افزایش عملکرد دستگاه و ایمنی پرسنل دارد. این نکات عبارتند از:

1. تمیز نگه داشتن و ضدعفونی مرتب محفظه داخل دستگاه در کاهش انتشار آلودگی‌ها نقش بسیار مهمی دارد.
2. محل قرار گرفتن دستگاه باید صاف و کاملاً افقی باشد.
3. در کار روزانه نباید سانتریفیوژ را با درب باز به کار انداخت.
4. سانتریفیوژ را باید در محلی محکم و بدون لرزش قرار داد.
5. استفاده از لوله‌های مناسب و توصیه‌شده توسط سازنده
6. رعایت توازن لوله‌ها و حجم نمونه‌ها به‌طوری‌که وزن لوله‌های حاوی نمونه که مقابل هم قرار می‌گیرند بیش از یک درصد تفاوت نداشته باشند. وزن مجموع لوله‌های حاوی نمونه نیز نباید از وزن تعیین‌شده برای سرعت خاص تجاوز نماید.
7. اگر دستگاه دارای سیم اتصال به زمین است برای پیش‌گیری از خطر برق‌گرفتگی آن را به سیستم اتصال زمین آزمایشگاه و یا حداقل به لوله فلزی آب سرد وصل کنید.
8. هرگز از لوله‌های دارای ترک و یا خوردگی استفاده نشود.
9. بعد از شکستن یا ریختن نمونه در سانتریفیوژ، فوراً آن را خاموش کنید، پنجره‌ها را باز کرده و به مدت ۱۵ دقیقه اتاق را ترک کنید تا آئروسل‌های (مخلوطي از ذرات بسيار ريز مايع يا جامد معلق در هوا) بزرگ ته‌نشین و با هوا رقیق شوند و سپس با ماسک و دستکش و با ماده ضدعفونی مناسب آن را تمیز و ضدعفونی کنید.
10. بعد از استفاده جالوله‌ای‌ها شسته و خشک شوند.
11. در صورت شنیدن صدای ناهنجار یا لرزش غیرعادی فوراً سانتریفیوژ را خاموش کنید.
12. تعویض به‌موقع ذغال موتور و روغن‌کاری آن موجب افزایش عمر مفید دستگاه می‌شود.
13. بستن درب لوله‌های حاوی خون قبل از سانتریفیوژ جهت جلوگیری از پخش آئروسل در محیط
14. عدم استفاده از اپلیکاتورهای چوبی جهت خارج کردن لخته به علت افزایش احتمال همولیز نمونه
15. از افزایش و یا کاهش ناگهانی سرعت دستگاه هنگام کار اجتناب شود.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

نگهداری معمول

نگهداری معمولی سانتریفیوژ به عوامل متعددی مانند تکنولوژی بکاررفته، میزان استفاده، آموزش، کیفیت جریان برق مصرفی و شرایط محیطی بستگي دارد. موارد زیر شامل نگهداری معمول برای استفاده مطلوب و صحیح کارکردن با سانتریفیوژ است. تعمیرات معمولي و یا تخصصی برای هر بدنه و مدل براساس توصيه‌هاي سازنده می‌باشد. همیشه بدنه سانتریفیوژی که برای جداسازی نمونه‌های باليني و عفونی استفاده می‌شود، را داخل سبدهای نگهدارنده بگذارید و محور را پيش از هرگونه سرویس، ضدعفوني نماييد.

ضمن اینکه لازم است به‌منظور پیشگیری از نوسانات جریان الکتریکی، دستگاه به سیستم تثبیت‌کننده جریان برق متصل باشد.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

مدیریت مناسب و توصيه‌هاي نگهداری

• محورهای چرخان

1. تاریخ خریداری هر محور چرخان شامل اطلاعات لازم مانند سریال و شماره مدل را ثبت نمایید.
2. دفترچه راهنمای سانتریفیوژ، وسایل جانبي و لوله‌ها را پیش از استفاده به‌طور کامل بخوانید.
3. این محورهاي چرخان را فقط در سانتریفیوژهایی استفاده‌کنیدکه برای آن طراحی شدند.
4. ويژگي و شرايط هر محور چرخان را در دفتر خاص سانتریفیوژ ثبت نمایید تا زمان جایگزینی آنها مشخص شود.
5. از توصیه‌های لازم سازنده برای حداکثر سرعت و غلظت نمونه‌ها استفاده نمایید. هر محور چرخان براي کار مشخصی طراحی شده است و این توصیه‌ها باید حتماً بکار گرفته شوند.
6. هنگام کار با محلول‌های غلیظ در لوله‌های استیل یا پلاستیک که توسط سازنده تهیه شده‌اند، از سرعت بالا استفاده نکنید.
7. اگر اکثراً با محلول نمكي (Saline) کار می‌کنید، از محورهای چرخان تیتانیم (Titanium) استفاده نمایید.
8. از پوشش محور چرخان محافظت کرده و از محلول‌های تمیزکننده قلیایی و یا محلول‌های حل‌کننده این پوشش استفاده نکنید. جنس محورهاي چرخان معمولاً از آلومینیوم است و با پوشش آندي آلومینیوم پوشیده شده‌اند که از ساختار فلزی آنها محافظت می‌کند.
9. برای تمیز کردن محور چرخان از برس‌های پلاستیکی استفاده نمایید. برس‌های فلزی روی پوشش محافظ خراش ايجاد مي‌كنند و سبب فرسودگی آنها در طول زمان می‌شوند. همچنین فرسودگی و خوردگی با توجه به شرایط محیطی می‌تواند تسریع شده و سبب تقلیل مدت زمان استفاده از محور چرخان گردد.
10. اگر قطراتی از مواد خورنده روی محور ریخته است، سریعاً آن را پاک نمایید.
11. پس از اینکه محور چرخان سانتریفیوژ با آب شسته شد، با هوای پرفشار خشک نمایید.
12. محور چرخان با لوله‌های عمودی يا تقریباً عمودی را به روشی که سطح بزرگ آنها رو به پایین و بدون در باشد، نگهداری کنید.
13. محور چرخان را در یک محل خشک نگهداری کنید و آن‌ها را به‌طور دائم در سانتريفیوژ نگذاريد.
14. سبدهاي شناور محور چرخان را بدون روکش نگهداری نمایید.
15. فنر و واشرها را با توجه به توصیه‌های سازنده روغن‌کاری کنید.
16. به توصیه‌های مربوط به مدت زمان ضمانت و استفاده از انواع مختلف محورهاي چرخان توجه کنید.
17. از محورهاي چرخان کهنه استفاده نکنید.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

• لوله‌ها

مواظبت از لوله‌ها شامل پرکردن لوله‌ها، انتخاب دمای مناسب و محدوده سرعت سانتریفیوژ و همچنين شستن و استریل بودن آنها است. توصیه‌های اصولی شامل نکته‌های زیر است:

1. لوله‌ها، آداپتور و دیگر لوازم جانبی را با استفاده از محلول تميز‌کننده در آب و برس‌های نرم غیرفلزی بشوييد. از دستگاه شستشوی خودكار براي اين منظور استفاده نکنید.
2. از استون و یا الکل برای شستشوی لوله‌ها استفاده نکنید. سازندگان، محلول‌های خاصی را برای هر نوع لوله سانتریفیوژ توصیه می‌کنند.
3. از خشک‌کردن لوله‌ها در فور خودداری کنید. همیشه از بخار هوای داغ برای این منظور استفاده کنید.
4. از يكبار مصرف نبودن لوله‌ها اطمینان حاصل نمایید. اگر آنها برای یکبار مصرف ساخته شده‌اند، دوباره از آنها استفاده ننمایید.
5. برای استریل نمودن، نوع مواد سازنده لوله‌های آزمایش را بشناسيد؛ چون تمام لوله‌ها نمی‌توانند گرمای مراحل استریلیزاسیون را تحمل کنند. لوله‌های شیشه‌ای معمولاً با فشار در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ دقیقه استریل می‌شوند.
6. لوله‌ها و شیشه‌ها را در محل تاریک، خشک و دور از بخارات مواد شیمیایی و یا اشعه ماوراي بنفش نگهداری کنید
7. ميزان پر بودن و بسته بودن درِ لوله‌های شیشه‌ای را برای جلوگیری از سقوط آنها داخل محور چرخان هنگام چرخیدن تعیین کنید. برای این منظور به توصیه‌های سازنده توجه کنید.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

نگهداری پیشگیرانه (Privative Maintenance)

نگهداری پیشگیرانه به مجموعه اقداماتی گفته می‌شود که با رعایت آنها عملکرد دستگاه بهتر، استهلاک آن کمتر و عمر مفید دستگاه افزایش می‌یابد. این اقدامات عبارتند از:

 

• اقدامات نگهداری ماهیانه:

1. تمیز کردن قطعات دستگاه از گرد و غبار و ذرات لوله‌های آزمایش شکسته
2. تمیز کردن بدنه دستگاه توسط مواد پاک‌کننده ملایم
3. کنترل کردن وضعیت روتور (rotor) دستگاه از نظر روغن‌کاری و سالم بودن ضربه‌گیرهای آن
4. کنترل وضعیت قفل درب دستگاه و اطمینان از صحت عملکرد آن
5. کنترل وضعیت درزها و واشرها از نظر آب‌بندی
6. اگر سانتریفیوژ یخچال‌دار است با استفاده از دماسنج‌های الکترونیک با دقت نیم درجه، دمای آن کنترل شود. نباید اختلاف دما بیش از ۲± درجه سانتی‌گراد باشد.

 

• اقدامات نگهداری شش ماهه

1. بررسی وضعیت ذغال های موتور و تعویض آنها در صورت خوردگی و یا کوتاه شدن
2. کنترل درستی عملکرد زمان‌سنج دستگاه با استفاده از زمان‌سنج‌های الکترونیک کالیبره

 

• اقدامات نگهداری سالیانه

1. تمیز کردن بردهای الکترونیکی دستگاه و نصب صحیح آنها در مکان خود
2. آزمایش درستی عملکرد قطعات کنترلی دستگاه مانند سرعت‌سنج، دماسنج، نشانگرهای آلارم و نمایشگر دستگاه
3. بررسی استانداردهای الکتریکی دستگاه توسط ابزارهای تحلیل‌گر ایمنی الکتریکی و تست مقاومت اتصال به زمین

 

کنترل کیفیت سانتریفیوژ

کنترل کیفیت سانتریفیوژ به‌منظور اطمینان از عملکرد صحیح قطعات دستگاه (سرعت موتور، زمان‌سنج و دما) در دوره زمانی مشخص انجام می‌شود و شامل مراحل زیر است:

۱: سرعت سانتریفیوژ: ابزار سنجش سرعت سانتریفیوژ، تاکومتر (Tachometer) است. سرعت سانتریفیوژ باید حداقل هر 3 ماه یک بار (4 بار در سال) بررسی شده و میزان سرعت اندازه‌گیری شده نباید بیش از 5 درصد با سرعت مورد انتظار (سرعت انتخابی هنگام کار با سانتریفیوژ) تفاوت داشته باشد.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

روش کار با تاکومتر برای سنجش سرعت سانتریفیوژ

• قفل سانتریفیوژ را در حالتی قرار دهید که در حال باز بودن درب دستگاه، چرخش انجام شود.
• کاغذ مخصوص همراه تاکومتر را نزدیک مرکز محور سانتریفیوژ (نه در روی مرکز محور) قرار دهید، این کار باعث می‌شود در هر بار چرخش، نور یکبار از کاغذ مخصوص، به تاکومتر بازتابیده شود.
• سانتریفیوژ را با دور موردنظر تنظیم نموده و روشن کنید.
• تاکومتر را در فاصله مناسب نسبت به کاغذ نشاندار نگه داشته و آن را روشن کنید.
• هنگامی که عدد نمایش داده شده روی تاکومتر ثابت ماند، آن را یادداشت نموده و با سرعت انتخاب شده اولیه مقایسه کنید (شکل ۱۰).

شکل ۱۰: تاکومتر

جدول ۱، جدولی پیشنهادی جهت یادداشت، بررسی و کنترل مواردی است که به آنها اشاره شد.

 

جدول ۱: جدول پیشنهادی جهت بررسی و کنترل سرعت سانتریفیوژ

تاریخ (۴ بار در سال)	۳ ماه اول	۳ ماه دوم	۳ ماه سوم	۳ ماه چهارم
دور تنظیم‌شده (rpm)
دور با تاکومتر (rpm)
درصد اختلاف

 

۲: زمان‌سنج سانتریفیوژ: بهتر است زمان‌سنج حداقل هر شش ماه یک بار در مقابل زمان‌سنج کالیبره مورد بررسی قرار گیرد. برای این امر زمان‌سنج را در زمان‌های مختلف تنظیم و با کرونومتر مقایسه کنید. اعداد حاصله نباید بیش از ۵ درصد با زمان تنظیم شده تفاوت داشته باشد.

 

جدول ۲، جدولی پیشنهادی جهت یادداشت، بررسی و کنترل مواردی است که به آنها اشاره شد.

 

جدول ۲: جدول پیشنهادی جهت بررسی و کنترل زمان سانتریفیوژ

تاریخ (۲ بار در سال)	۶ ماه اول سال		۶ ماه دوم سال
ردیف	کرونومتر کالیبره	زمان‌سنج سانتریفیوژ	کرونومتر کالیبره	زمان‌سنج سانتریفیوژ
زمان ۱
زمان ۲
زمان ۳
زمان ۴
زمان ۵
میانگین
درصد اختلاف

 

۳: کنترل دما یا حرارت: برای کنترل دما، می‌توان در لوله آزمایش، آب مقطر ریخته و دمای آن را تعیین کنیم. سپس لوله را در سانتریفیوژ قرار داده و دستگاه را با دور مشخص روشن کنیم. پس از مدت مقرر، دمای آبِ داخل لوله را مجدداً اندازه‌گیری کنیم. همانطور که پیش‌تر هم گفته شد هنگامی که اندازه‌گیری کمیتی موردنظر است که به دما حساس می‌باشد بهتر است از سانتریفیوژ یخچال‌دار استفاده شود. دمای این سانتریفیوژها می‌بایست هر ماه بررسی شده و میزان دمای اندازه‌گیری شده نباید بیش از ۲ درجه سانتی‌گراد با دمای مورد انتظار تفاوت داشته باشد. البته در برخی از استانداردها نیز گفته شده که در سانتریفیوژ معمولي تا ۵ درجه سانتی‌گراد افزايش دما قابل قبول می‌باشد. (اندازه‌گیری ۱۲ بار در سال).

جدول ۳، جدولی پیشنهادی جهت یادداشت، بررسی و کنترل مواردی است که به آنها اشاره شد.

 

جدول ۳: جدول پیشنهادی جهت بررسی و کنترل دمای سانتریفیوژ

ماه

۱

۲

۳

۴

۵

۶

۷

۸

۹

۱۰

۱۱

۱۲

دما قبل از سانتريفيوژ نمودن

دما بعد از سانتريفيوژ نمودن

اختلاف دما

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

کنترل کیفیت سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

دو نمونه خون تازه حاوی ضد انعقاد EDTA دی‌پتاسیک که به‌خوبی مخلوط شده‌اند را به‌صورت دوتایی به روش زیر سانتریفیوژ می‌کنیم:

ابتدا نمونه‌ها به مدت دو دقیقه سانتریفیوژ شده و مقادیر آنها ثبت می‌گردد. سپس در هر مرحله ۳۰ ثانیه به زمان انجام سانتریفیوژ اضافه می‌کنیم تا زمانی که میزان دو هماتوکریت اندازه‌گیری شده بدون تغییر باقی بماند. این زمان، به‌عنوان حداقل زمان لازم جهت متراکم شدن گلبول‌های قرمز در نظر گرفته می‌شود. این آزمایش بهتر است حداقل با یک نمونه دارای هماتوکریت ۰/۵ (۵۰%) یا بیشتر نیز انجام شود.

در جدول به‌طور نمونه مثالی ذکر گردیده است:

PCV		TIME
Sample 2	Sample 1
۰/۵۹	۰/۴	۲
۰/۵۸	۰/۳۹	۲/۵
۰/۵۷	۰/۳۸	۳
۰/۵۶	۰/۳۸	۳/۵
۰/۵۵	–	۴
۰/۵۵	–	۴/۵

 

داده‌های موجود در جدول بالا نشان می‌دهند زمان لازم جهت متراکم شدن گلبول‌های قرمز برای دستگاه میکروهماتوکریت مورد آزمایش، در نمونه‌ای با میزان هماتوکریت کمتر از ۰/۵، ۳/۵ دقیقه و برای نمونه‌ای با مقدار هماتوکریت بیشتر از ۰/۵، ۴/۵ دقیقه می‌باشد. این امر پس از خرید و قبل از شروع به کار دستگاه و حداقل هر ۶ ماه یکبار باید انجام شود.

درصورتی‌که ارزیابی عملکرد دستگاه میکروهماتوکریت به‌صورت مستقیم امکان‌پذیر نباشد، از روش توصیه‌شده سازمان بهداشت جهانی می‌توان جهت بررسی توان دستگاه به روش زیر استفاده نمود:

چند نمونه خون با هماتوکریت کمتر از 0/5 و حاوی ضد انعقاد EDTA دی پتاسیک (1/5میلی‌گرم برای هر میلی‌لیتر) را پس از حدود بیست بار سروته نمودن به‌صورت دوتایی به مدت سه، پنج، هفت، نُه و یازده دقیقه سانتریفیوژ کرده و نتایج ثبت می‌گردد. در صورت مناسب بودن توان دستگاه (g) نتایج حاصله از دقیقه 5 به بعد باید بدون تغییر باقی بماند.

در روش سوم به‌صورت زیر عمل می‌کنیم:

1. نمونه انتخاب‌شده را توسط شيكر هماتولوژي به‌خوبی مخلوط نماييد.
2. توسط لوله‌های ميكروهماتوكریت خون بيمار را كشيده به‌طوری‌که تقریباً یک سانتی‌متر از بالای لوله خالی بماند.
3. انتهاي لوله را به كمك خمير هماتوکریت مسدود نماييد.
4. لوله‌ها را در داخل شيارهاي موجود در دستگاه گذاشته و بعد درپوش فلزي دستگاه را روي آن ببنديد و درب آن را ببنديد.
5. عقربه تايمر را روي ‘٨ (هشت دقیقه) گذاشته كه بعد از اتمام اين مدت، دستگاه خودبه‌خود خاموش می‌شود.
6. لوله‌های ميكروهماتوريك را یکی‌یکی برداشته روي خط‌كش برده و می‌خوانیم.
7. لوله ميكروهماتوكريت را روي خط‌كش گذاشته خط مابین خمير و خون را روي صفر گذاشته و تا خط مابین پلاسما و خون را یادداشت كنيد. دوباره از خط صفر تا انتهاي پلاسما را نيز اندازه بگيريد، عدد دوم را تقسيم بر عدد اول كرده، عدد به دست آمده مقدار هماتوکریت است.

لازم به ذکر است در صورت وجود هرگونه اختلال در موارد ذکرشده در بالا، تماس با شرکت پشتیبان ضروری می‌باشد.

 

مشكلات گزارش‌شده

مهم است كه سرعت را كاليبره كرد و مدت زمان سیکل‌های سانتريفيوژ را مانيتور كرد. در سانتريفيوژهاي شستشوي سلول بايد ترمز كردن اتوماتيك چك شود تا اطمينان حاصل شود كه در زمان مشخص‌شده اتفاق مي‌افتد، به‌نحوی‌که شستن متوالي، خالي كردن و اضافه كردن معرف با ترتيب نادرست انجام نشوند. سيكل خالي كردن بايد كنترل شود تا از ماكزيمم خروج مايع، بدون از دست رفتن سلول‌ها اطمينان حاصل شود.

به خاطر اين‌كه سانتريفيوژها به‌صورت دائم استفاده می‌شوند و به خاطر خطرات احتمالي مربوط به استفاده از آن‌ها، اغلب توليدكنندگان توصيه می‌کنند كه حتماً نگهداری‌های پيشگيرانه به‌صورت مداوم انجام شوند. جريان نشتي، مقاومت زمين و سیستم‌های قفل ايمني روي سرپوش‌ها و سایر موارد بايد دائماً كنترل شوند.

سانتريفيوژها، جریان زيادي را مصرف می‌کنند كه منجر به ايجاد نويز الكتريكي گذرا روي خطوط برق می‌شوند. تحت اين شرايط ابزارهاي تحليلي مانند اسپكتروفتومترها، آنالايزرهاي شيمي باليني يا آنالايزرهاي هماتولوژي ممكن است درست عمل نكنند، بنابراين سانتريفيوژها بايد فقط به مداراتي كه براي دستگاه‌هاي غيرتحليلي اختصاص داده شده‌اند، متصل شوند.

روتورهاي سانتريفيوژها به‌صورت خاص به زوال ناشي از ايجاد مواد خارجي حساس هستند و بايد به‌صورت منظم بازرسي و تميز شوند. روتورها بايد به‌صورت پريوديك تعويض شوند. در غير اين صورت ممكن است از كار بيفتند و شايد منجر به خرابي سانتريفيوژ شوند. روتورها بايد به‌صورت مناسب روي سانتريفيوژ نصب شوند زيرا لق خوردن موجب سائيدگي زياد اجزاي موتور می‌شود. اگر روتور محكم بسته نشده باشد ممكن است در سرعت‌های خيلي زياد از جا دربیاید.

مواد شيميايي خورنده‌اي كه در برخي از مايعات تميزكننده يافت می‌شود می‌تواند موجب سوراخ سوراخ شدن سطح روتور شود، بنابراين تنها مواد تعیین‌شده توسط سازنده بايد براي تميز كردن و نگهداري روتور استفاده شود. فركانس نگهداري پيشگيرانه براي اجزاي مختلف سيستم متفاوت است.

(Emergency Care Research Institute)-ECRI، گزارشي از يك حالت دريافت كرده است كه در آن تيوب يك سانتريفيوژ در حين استفاده، شكسته و محصولات خوني و شيشه از زير سرپوش به سينه يك تكنولوژيست پزشكي پاشيده و وي را در معرض عفونت و جراحت قرار داده است. شكستن تيوب می‌تواند در سانتريفيوژ به خاطر عدم تنظيم روتور، تيوب‌هاي قديمي يا معيوب يا استفاده ناصحيح رخ دهد. ECRI توصيه می‌کند كه از سانتريفيوژهاي با قفل (interlock) و یا چفت ايمني سرپوش استفاده شود كه زماني كه سرپوش باز می‌شود موتور را خاموش می‌کنند يا تا زماني كه روتور در حال چرخش است و متوقف نشده، سرپوش را بسته نگه مي‌دارند.

اپراتورها بايد بدانند كه لرزش‌‌هاي زياد در سرعت‌های بالاي خاصي براي هر دستگاه اتفاق مي‌افتند. اين شرايط ديناميكي كه به‌عنوان رزونانس شناخته می‌شود، با تركيبي از لرزش‌هاي مكانيكي اجزاي در حال حركت ايجاد می‌شود. سانتريفيوژها بايد در سرعت‌های كمي بالاتر يا كمي پائين‌تر از سرعت رزونانس آن‌ها استفاده شوند تا از فرسايش شديد آن‌ها جلوگيري شود.

اپراتورها بايد هميشه در زمان انجام سانتريفيوژ و ديگر اعمالي كه امكان در معرض قرار گرفتن پاشيدگي خون و ديگر مايعات بدن، در آن‌ها هست، احتياط‌هاي كلي را انجام دهند. اين احتياط‌ها شامل پوشيدن دستكش‌هاي يك بار مصرف، پوشش محافظتي صورت، گان يا لباس‌هاي آزمايشگاهي است.

 

جداول مشكل‌يابي

در جدول‌های مشکل‌یابی، به شرح مشکلات احتمالی سانتریفیوژ، علت وقوع آن‌ها و چگونگی رفع این مشکلات پرداخته شده است.

محورهای چرخان
مشکل	علت محتمل	راه‌حل
لرزش شدید	محور چرخان بالانس نيست	بارگذاری محور چرخان را تنظيم كنيد
		وزن لوله‌هاي مقابل هم بايد یکسان و متقارن باشد
	سرعت انتخاب شده به سرعت بحراني نزديك است	محورهاي چرخان در سانتريفیوژهاي زاويه ثابت و عمودي را متقارن بارگذاری کنید
	محور چرخان خوب جاسازي نشده است	سرعت مناسب و خارج از محدوده‌ی سرعت بحراني انتخاب نماييد
	پايه‌ی محور چرخان روغنكاري نشده و يا كم روغنكاري شده است	اطمينان حاصل نماييد كه محور چرخان درست جاسازي شده است و آن را كنترل كنيد
		محور چرخان را با توجه به توصيه‌هاي سازنده روغنكاري نماييد
درب و محفظه‌ی محور چرخان بعد از سانتريفیوژ کردن به‌سختی باز می‌شود	حین سانتریفیوژ کردن، خلأ ایجاد می‌شود	قسمت تهويه را در سمت بالاي محور چرخان يا سبد لوله‌ها باز كنيد تا خلأ از بين برود
	واشرها با روغن و يا ذرات فلزي آلوده شده‌اند	واشرها را تميز و روغنكاري نماييد. از توصیه‌هاي سازنده براي اين منظور استفاده نماييد

 

 

لوله‌ها
مشکل	علت محتمل	راه‌حل
لوله‌ها نشتي ‌دارند	درِ لوله‌ها محكم بسته نشده است	درِ لوله‌ها را تنظيم و محكم نماييد
		سطح مايع بايد پايينتر باشد تا از نشتي لوله‌ها جلوگيري شود
	لوله‌ها خيلي پر هستند	حجم و سرعت توصيه شده براي سانتريفیوژ را كنترل نماييد
	سطح مايع ‌در‌ لوله‌های ‌درباز، از‌ حد توصيه شده بیشتر است	با حرکت ملایم در لوله را به‌آرامي گرم كنيد (که محتویات در اثر گرما آسیب نبینند) چنانچه لوله‌ها هنوز نشتی وجود دارد، درِ آنها را محکم‌تر ببنديد
	درِ لوله‌ها محكم بسته نشده‌ است
لوله‌ها ترک خورده و یا شکسته شده‌اند	اگر لوله‌ها در دماي کمتر از دماي توصيه‌شده استفاده شوند، ممکن است ترک ‌خورده و يا بشكنند	اگر نمونه يخزده‌ است، دماي آن را پيش از سانتريفیوژکردن به ۲ درجه سانتی‌گراد برسانيد. عملكرد لوله‌ها را در دماي پايين، پيش از سانتريفیوژ كردن ارزيابي نماييد
	لوله‌ها بر اثر استفاده، ممکن است شكننده شوند	لوله‌هاي تاريخ‌گذشته را دور بريزيد و از لوله‌های نو استفاده كنيد

 

 

 

 

 

سيستم‌هاي مختلف
مشکل	علت محتمل	راه‌حل
سوئیچ اصلی، روشن بودن دستگاه را نشان می‌دهد، ولی سانتریفیوژ كار نمی‌کند	جريان الكتريكي به دستگاه وارد نمی‌شود	از عملكرد منبع تغذيه اطمينان حاصل كنيد
درِ سانتريفیوژ باز نمی‌شود	سانتریفیوژ خاموش است	سانتريفیوژ را روشن نماييد. دسته را فشار داده و در را باز كنيد
دكمه‌ی عدم تعادل فعال است	لوله‌ها در سانتريفیوژ بالانس نيستند	لوله‌ها را بالانس نماييد
	سانتريفیوژ تراز نيست	سانتريفیوژ را در يك سطح تراز قرار دهيد
در سرعت كم، سانتریفیوژ لرزش دارد	مكانيسم تنظيم محور چرخان گیر دارد	مكانيسم تنظيم محور چرخان را كنترل و تنظيم نماييد
	لوله‌ها در سانتريفیوژ بالانس نيستند	از بالانس بودن لوله‌ها اطمينان حاصل نماييد
	سرعت انتخابی به رزونانس محورچرخان نزدیک است	يك سرعت بالاي ديگر انتخاب كنيد و يا از نوع ديگر محور چرخان استفاده كنيد
در سرعت چرخش نوسان وجود دارد	وضعیت تسمة انتقال سرعت بد است	سانتريفیوژ را خاموش و شرايط تسمه را كنترل كنيد. تسمه بايد میزان باشد
سرعت چرخش به حداكثرسرعت انتخابی نمی‌رسد	ذغال‌ها معيوب هستند.	سانتريفیوژ را خاموش نماييد. از سالم بودن ذغال‌ها اطمينان حاصل كنيد. در صورت لزوم، ذغال‌ها را با ذغال نو و با مشخصات يکسان جايگزين نماييد
	كنترل سرعت كاليبر نيست	سرعت‌سنج را کاليبر نماييد.
محفظه سرد، ولي محورچرخان گرم است	دمای صحيح انتخاب نشده است	از انتخاب صحيح دما اطمينان حاصل نماييد
در صفحة نمایش دکمه نشان‌دهنده‌ی وضعيت ذغال روشن است	ذغال‌ها در شرايط بدي هستند	سانتريفیوژ‌ را خاموش نماييد. از سالم بودن ذغال‌ها اطمينان حاصل كنيد. ذغال‌ها را با ذغال نو و با مشخصات يکسان جايگزين نماييد

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

رفراكتومتري يا شكست سنجي

ارنست آبه (Ernest Karl Abbé) فیزیکدان آلمانی و از مهندسان کارخانه زایس آلمان بود که عدد آبه- Abbé number را کشف کرد. عدد آبه رابطه‌ای بین ضریب بازتاب و طول‌موج را نشان می‌دهد. آبه بیشتر در نورشناسی مشهور است و اولین رفراکتومتر را در اواخر دهه‌ی 1800 میلادی طراحی نمود (شکل 11).

شکل ۱۱: رفراکتومتر طراحی شده توسط آبه در اواخر دهه‌ی ۱۸۰۰

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

رفراكتومتري-Refractometry به معني تعيين ضريب شكست گازها، مايعات و جامدات نيمه‌شفاف، به‌وسیله دستگاه رفراكتومتر است. می‌توان از اين مشخصه، براي شناسايي مواد يا ارزيابي خلوص آن استفاده كرد. با معين شدن ضريب شكست، علاوه بر شناسايي مواد، مقدار آن را نيز می‌توان محاسبه كرد. دستگاه رفراكتومتر كاربرد زيادي در صنايع گوناگون دارد؛ به‌عنوان مثال براي اندازه‌گیری غلظت نمك طعام در حوضچه‌های پرورش ماهي یا در کارخانه‌های قند برای تعیین بریکس–Brix محلول قند مورد استفاده قرار می‌گیرد. در پزشكي براي پي بردن به ميزان اوره و پروتئين خون، ميزان نمك موجود در آن و غلظت مايعات استفاده می‌شود و مهم‌ترین كاربرد آن تعيين غلظت ادرار در آزمايشگاه است.

هنگامی‌که پرتو نور از محيطي به محيط ديگر با غلظتي متفاوت وارد می‌شود، به علت تغيير سرعت عبور، مسير آن منحرف می‌شود. اين پديده شكست نور Refraction-ناميده می‌شود. درصورتی‌که محيط دوم چگال‌تر از محيط اول باشد، نور به خط عمود نزدیک‌تر می‌شود و درصورتی‌که محيط دوم غلظت كمتري داشته باشد از خط عمود بر سطح دور می‌شود.

همانطور که در شکل 12 نشان داده شده است، زاویه بین شعاع تابش و خط عمود، زاویه تابش i و زاویه بین شعاع شکست و خط عمود، زاویه شکست r نامیده می‌شود. ضریب شکست مطلق یک ماده عبارت است از نسبت سرعت عبور نور در خلأ به ‌سرعت عبور نور از آن ماده. ضریب شکست هر جسم به‌صورت زیر تعریف می‌شود:

 

برای اهداف کاربردی به‌جای خلأ، به‌عنوان مرجع از هوا استفاده می‌شود، چراکه ضریب شکست آن بسیار نزدیک به خلأ می‌باشد. ضریب شکست، مانند نقطه ذوب از خواص فیزیکی مواد بوده و می‌توان از این مشخصه برای شناسایی مواد یا ارزیابی خلوص آن استفاده نمود. با مشخص شدن ضریب شکست، علاوه بر شناسایی ماده، مقدار آن را نیز می‌توان محاسبه کرد.

شکل ۱۲: ضریب شکست

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

ساختار رفراكتومترها و اساس كار آنها

اساس كار رفراكتومتر در تابش نور به‌شرط تكفام بودن آن و هدايت آن به سمت محلول موردنظر و عبور آن است كه چون اين دو محيط با هم ضرايب شكست متفاوت دارند، نور شكست پيدا می‌کند. درون رفراكتومتر خط نوريي ديده می‌شود كه با منشورها و عدسي‌هاي مختلف به وجود می‌آید. اين خط نور با كمك عدسي سر دوربين (قطعه چشمي) توسط كاربر قابل مشاهده است. در دستگاه رفراكتومتر نور از محيط رقيق وارد محيط غليظ می‌شود كه محيط رقيق، مايع يا محلول موردنظر و محيط غليظ، منشور دستگاه است. درواقع، در عمل، ضريب شكست محلول و منشور نسبت به هم سنجيده می‌شود.

N، ضریب شکست محیط غلیظ. n، ضریب شکست محیط رقیق. i و r به ترتیب زوایای تابش و شکست

هر دستگاه رفراكتومتر داراي دو منشور است كه يكي انتشاردهنده- Diffusing و ديگري شكست دهنده Refracting است. نمونه موردنظر بين اين دو منشور قرار می‌گیرد. نور مشخص وارد نمونه مورد آزمايش و منشور انتشاردهنده شده و تجزيه می‌شود، اين نور بازتاب يافته و سپس به منشور شكست‌دهنده می‌رود (ورود نور از محيط رقيق به غليظ). نکته مهم این است که قبل از ریختن نمونه، منشورها باید کاملاً تمیز باشند.

دو عدسی در رفراكتومتر وجود دارد؛ یکی عدسیِ مربوط به ‌وضوح تصویر که توسط پیچ مربوطه کنترل می‌شود و دیگری عدسی‌ای که پس از منشور شکست‌دهنده قرار دارد و موجب تمرکز تصویر بر روی صفحه نمایش مندرج می‌گردد. همچنين بعضی از رفراکتومترها داراي دماسنج‌اند كه براي تنظيم و گزارش دما می‌باشد. در نهايت آنها داراي پیچ‌هایی جهت تنظيم تصوير هم می‌باشند. درواقع دو پیچ تنظیم موجود است؛ یکی برای تنظیم صفر دستگاه توسط آب قبل از سنجش نمونه و دیگری پیچ مربوط به کانونی کردن تصویر به‌منظور وضوح بیشتر آن.

اولين نمونه از اين دستگاه که در اواخر دهه 1800 ميلادي توسط آبه طراحی شد شامل دماسنج‌های توكار و سيستم چرخش آب بود كه براي كنترل دماي دستگاه و مايعات استفاده می‌شد. پس از آن دستگاه‌ها مجهز به ميكروسكوپ نيز شدند. امروزه اين دستگاه‌ها در چهار نوع مختلف يعني رفراكتومتر دستي آنالوگ، رفراكتومتر روميزي، رفراكتومتر دستي ديجيتال و رفراكتومتر این‌لاين- inline refractometer موجودند.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

رفراكتومترهاي دستي

در اين رفراكتومترها، نور مورد استفاده، نور سفيد می‌باشد كه تمامي رنگ‌ها را شامل می‌شود. با تابش نور به منشور رفراكتومتر كه نمونه مورد آناليز روي آن قرار می‌گیرد، می‌توان مقدار ضريب شكست نمونه و همچنين وزن مخصوص آن را از روي صفحه مدرج آن قرائت كرد. اين نوع رفراكتومتر بسيار ساده و ابتدايي است. اجزاء تشکیل‌دهنده آن شامل منشور، محافظ منشور، پيچ تنظيم و قطعه چشمي می‌باشد. نمونه‌هایی از آن در شکل ۱۳ و ۱۴ و ۱۵ آورده شده است.

 

شکل ۱۳: نمونه‌ای از رفراكتومترهاي دستي

شکل ۱۴: نمونه‌ای از رفراكتومترهاي دستي

شکل ۱۵: اجزای رفراكتومترهاي دستي

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

رفراكتومترهاي پایه‌ای– رومیزی

در اين رفراكتومتر، نور مورد استفاده می‌تواند نور حاصل از لامپ رفراكتومتر و يا نور سفيد باشدكه تمامي رنگ‌ها را شامل می‌شود. با روشن كردن دستگاه و مشاهده در قطعه چشمي آن، می‌توان مقدار ضريب شكست و همچنين وزن مخصوص و سرم پروتئين نمونه را از روي صفحه مدرج آن قرائت كرد. قسمت‌های مختلف يك رفراكتومتر پایه‌ای، همچنان که در شكل ۱۶ شماره نشان داده شده است، عبارتند از:

1. صفحه شفاف (Daylight plate): اين قسمت روي منشور قرار داده می‌شود تا نمونه به‌طور يكنواخت روي منشور قرار گيرد و از طرفي نيز به‌عنوان محافظ براي منشور می‌باشد.
2. منشور (Prism): در رفراكتومتر يك منشور ظريف با زاويه قائمه بكار می‌رود، سپس محافظي كه جنس آن شفاف است، روي آن قرار گرفته تا نور به‌خوبی بتواند از آن عبور كرده و به نمونه‌ای كه بر روي آن قرار دارد بتابد. با تابش نور به منشور و مطابق با شكست نور، فاكتورهاي موردنظر اندازه‌گیری می‌شوند.
3. پيچ تنظيم: اين قسمت براي كاليبره كردن دستگاه مورد استفاده قرار می‌گیرد كه می‌بایست با بكار بردن يك محلول استاندارد و شناخته‌شده كه غلظت و ضريب شكست آن مشخص می‌باشد، تنظيم آن صورت گيرد. اساساً هر از چند گاهي می‌بایست اين كار انجام شود.
4. قطعه چشمي (Eyepiece): با نگاه كردن به درون آن می‌توان مقادير قابل اندازه‌گیری را روي خط‌کش‌های مدرج‌شده قرائت كرد. البته هر شخص می‌بایست، قطعه چشمي را براي چشم خود تنظيم نمايد، چرا كه قدرت تیزبینی اشخاص با يكديگر فرق می‌کند و با تنظيم آن بايد بتوان به‌طور واضح مقادير را قرائت كرد.
5. دماسنج: ازآنجایی‌که فركانس نور فرودي به نمونه و منشور، تابع دما می‌باشد، بنابراين براي تمامي مقادير اندازه‌گیری شده، بايد دما مشخص گردد و تمامي اندازه‌گیری‌ها در يك دماي ثابت گزارش شود.

شكل ۱۶: رفراكتومترهاي پایه‌ای– رومیزی

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

احتياطات لازم براي كار با رفراكتومتر

چون منشور دستگاه بسيار ظريف و حساسي می‌باشد، بنابراين ممكن است با اندك ضربه، خط‌الرأس آن بشكند. بدين منظور در ضمن كار با آن می‌بایست دقت لازم را بكار برد. قبل از آزمايش، بايد مواظب بود كه منشور كاملاً خشك، پاك و شفاف باشد و پس از آزمايش نيز می‌بایست، دقيقاً تميز شده و با پارچه‌ای نرم، خشك شود. در صورت لزوم براي شستن آن، بايد از حلال‌هایی استفاده كرد كه نمونه مورد آزمايش را به‌خوبی در خود حل كرده و منشور كاملاً تميز شود. در استفاده مداوم از اين دستگاه‌ها، مهم‌ترین مسئله تميز كردن دقيق آن است. گرد و غبار و ذرات ريز بزرگ‌ترین دشمن دقت اندازه‌گیری است. براي پرهيز از ساييده شدن صفحه شیشه‌ای منشورها بهتر است براي پاك كردن از گوي پنبه‌ای استفاده نموده و به‌آرامی گرد و غبار پاك گردد و سپس آن را با پنبه جديد و الكل شستشو داد.

سانتریفیوژ و رفراکتومتری

کالیبراسیون رفراکتومتر

برای کالیبراسیون و تعیین میزان خطای دستگاه از آب مقطر (ترجیحاً آب تهیه شده به روش R.O.) که دارای وزن مخصوص n = 1.3325 می‌باشد، استفاده می‌کنیم. به این صورت که چند قطره آب مقطر روی صفحه شیشه‌ای دستگاه می‌ریزیم، سپس در مقابل نور مرئی میزان چگالی آب را مشاهده می‌کنیم. اگر مقدارِ بیش از صفر را نشان داد توسط پیچ تنظیم (پیچ کالیبره کننده) آن را صفر نموده و مجدداً این کار را تکرار می‌کنیم تا دستگاه کالیبره شود. سپس توسط ماده‌ای دیگر که میزان چگالی آن توسط چگالی‌سنج- hydrometer مشخص شده است، آزمایش را انجام می‌دهیم. نکته‌ای که باید توجه داشت این است که رفراکتومتر به تغییر حرارت حساس می‌باشد، بنابراین بهتر است اجازه داده شود تا دمای نمونه به دمای اتاق برسد و بعد قرائت انجام شود.

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی : عبارت جامعي است براي يك مجموعه از تکنیک های ازمایشگاهی مورد استفاده در جداسازي تركيب‌ها؛ به بیان بهتر کروماتوگرافی يك روش جداسازي توانمند است كه در تمام شاخه‌هاي علوم كاربردهايي دارد و به‌طور گسترده برای جداسازی، شناسایی و تعیین اجزای سازنده شیمیایی در مخلوط‌های پیچیده بکار می‌رود. تا اواسط قرن نوزدهم، جداسازی‌های تجزیه‌ای عمدتاً‌ به‌وسیله روش‌های کلاسیک مانند رسوب‌گیری، تقطیر و استخراج انجام می‌شد، كمي بعد از شروع قرن بيستم، كروماتوگرافي توسط گياه‌شناسي روسي، ميخائيل تسوت-  MikhailTswett ابداع و نامگذاري شد.

او اين فن را براي جدا كردن رنگدانه‌هاي گياهي مختلف از قبيل كلروفيل و زانتوفيل، با عبور دادن محلول‌هايي از اين تركيبات از داخل يك ستون شيشه‌اي كه با گرد نرم كلسيم كربنات انباشته شده بود، بكار برد. از آنجا كه گونه‌هاي جداشده به‌صورت نوارهاي رنگي در ستون ظاهر شدند، وي نام كروماتوگرافي را براي اين روش انتخاب كرد. لازم به ذکر است که در زبان يوناني كروما- chroma يعني «رنگ» و گرافي- graphein يعني نوشتن.

كاربرد كروماتوگرافي نه تنها به دليل ابداع چند نوع جديدِ فن كروماتوگرافي، بلكه به دليل افزايش نياز دانشمندان به روش‌هاي بهتر براي تشخيص اجزاي مخلوط‌هاي پيچيده، به‌طور حیرت‌آوری گسترش يافته است. تأثیر شگفت‌آور اين روش‌ها بر علم را مي‌توان با اهداي جايــــــــــزه نوبل ۱۹۵۲ به مارتين و سينج-  A. J. P. Martin and R.L. M. Syngeبه پاس اكتشافات آنها در زمينه كروماتوگرافي دريافت. شايد نشانه بارزترين تأثیر، فهرستي از دوازده جايزه نوبل باشد كه بين سال‌های ۱۹۳۷ و ۱۹۷۲ به پاس تلاش‌هايي اهدا گرديده است كه در آنها كروماتوگرافي نقش حياتي داشته است. هم‌اکنون اين فهرست بدون شك به‌طور قابل‌توجهی افزايش يافته است.

در تمام جداسازي‌هاي كروماتوگرافي، نمونه، در يك فاز متحرك كه ممكن است گاز، مايع يا سيال ابر بحراني-  Supercritical Fluid باشد، حل مي‌شود. سپس اين فاز متحرك از درون يك فاز ساكن امتزاج‌ناپذير كه بر سطح يك جامد يا در محلي داخل ستون تثبيت شده است، با فشار عبور داده مي‌شود. دو فاز طوري انتخاب مي‌شوند كه اجزاي نمونه خود را با درجات مختلفي بين فاز ساكن و متحرك توزيع كنند. آن اجزائي كه با فاز ساكن قوياً نگه داشته مي‌شوند به آهستگي با جريان فاز متحرك حركت مي‌كنند.

در مقابل، اجزائي كه به‌طور ضعيف به‌وسیله فاز ساكن نگه داشته مي‌شوند، به‌سرعت حركت مي‌كنند. در نتيجه‌ي اين اختلافات در تحرك، اجزاي نمونه به نوارهاي مجزا جدا مي‌شوند كه مي‌توان از آنها در تجزيه‌ي كيفي و يا كمي استفاده كرد. فاز ساکن، مايع و يا جامد و فاز متحرك، گاز و مايع مي‌باشد. عاملي كه بين تمام روش‌هاي كروماتوگرافي مشترك است، اختلاف در آهنگ حركت مؤلفه‌هاي مخلوط در فاز متحرك است كه در اثر واكنش بين مؤلفه‌هاي با فاز ساکن كه براي جداسازي اجزاء بکار مي‌رود، اتفاق مي‌افتد.

روش‌هاي كروماتوگرافي را مي‌توان به دو طريق دسته‌بندی كرد؛ اولين طريق بر اساس ابزار فيزيكي بنا شده است كه به كمك آن فازهاي متحرك و ساكن با يكديگر تماس برقرار مي‌كنند. در كروماتوگرافي ستوني، فاز ساكن در يك ستون باريك قرار دارد كه از داخل آن فاز متحرك تحت تأثیر نيروي فشار عبور داده مي‌شود. در كروماتوگرافي مسطح، فاز ساكن بر روي يك صفحه مسطح و يا در لابه‌لای يك صفحه كاغذ قرار داده مي‌شود؛ در اينجا فاز متحرك از لابه‌لای فاز ساكن تحت اثر مويينه‌اي حركت مي‌كند.

يك دسته‌بندی اساسي‌تر روش‌هاي كروماتوگرافي بر پايه انواع فازهاي متحرك و ساكن و انواع تعادل‌هاي درگير در انتقال مواد حل شده بين فازها بنا شده است. سه گروه عمومي كروماتوگرافي مايع- LC، كروماتوگرافي گازي- GC و كروماتوگرافي سيال ابر بحراني- SFC. همانطور كه از نام آنها پيداست، فاز متحرك در سه گروه به ترتيب عبارتند از: مايعات، گازها و سيالات ابر بحراني. به بیان دیگر، اگر فاز متحرک گاز باشد، سیستم حاصل کروماتوگرافی گازی نامیده می‌شود و اگر فاز متحرک مایع باشد، نتیجه یک سیستم کروماتوگرافی مایع خواهد بود. اگر فاز متحرک سیال فوق بحرانی باشد، کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی نامیده می‌شود که این سیال از نظر حلالیت شبیه مایعات است و از نظر نفوذپذیری شبیه گازهاست. کروماتوگرافی سیال فوق بحرانی یک نوع هیبرید از کروماتوگرافی گازی و مایع است که بعضی از بهترین جنبه‌های هردو را ترکیب می‌کند.

اگر به‌طور خلاصه بخواهیم اشاره کنیم، در واقع کروماتوگرافی متکی بر حرکت نسبی دو فاز است. یکی از فازها بدون حرکت است و فاز ساکن نامیده می‌شود و دیگری را فاز متحرک می‌نامند. مخلوط نمونه بین دو فاز در بستر کروماتوگرافی (ستون یا صفحه) توزیع می‌شود.

در ادامه به بررسی کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا می‌پردازیم.

 

كروماتوگرافي مايع با کارایی بالا

High Performance Liquid Chromatography technique

واژه‌ی کروماتوگرافی مایع، دربرگیرنده‌ی تکنیک‌های جداسازی مختلفی همچون کروماتوگرافی مایع- جامد، مایع- مایع، تبادل یونی و به‌دام اندازی بر اساس ابعاد ذرات می‌باشد که در تمامی آنها فاز متحرک مایع می‌باشد. در نوع کلاسیک کروماتوگرافی مایع، یک ستون شیشه‌ای با قطر بالا محتوی فاز ساکن وجود دارد که فاز متحرک با توجه به نیروی جاذبه از بین آن عبور می‌کند. این فرآیند نسبتاً آهسته بوده و آزمایش‌های مکرر با آن خسته‌کننده می‌باشد. از حدود سال ۱۹۶۹ میلادی، این روش با ساخت دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا- HPLC توسعه یافت.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا روشی است توسعه یافته با مبنای کروماتوگرافی مایع که قطر ذرات داخل ستون‌های آن بسیار کوچک شده و جداسازی را بهتر انجام می‌دهند و همچنین در درون این سیستم‌ها، پمپ‌هایی وجود دارند که سرعت تعادلی مناسب ایجاد می‌نمایند. به‌طور کلی، استفاده از انواع آشکارسازهای اسپکتروفتومتری، فلوئوریمتری، الکتروشیمیایی، ضریب شکست و غیره و همچنین پیشرفت‌هایی که در ساخت ستون، پمپ و سایر تجهیزات HPLC پدید آمد، کارایی، سرعت جداسازی و دامنه کاربردهای این روش را به‌طور قابل ملاحظه‌ای افزایش داد.

در حال حاضر در میان روش‌های مختلف جداسازی تجزیه‌ای، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از بیشترین رشد برخوردار می‌باشد. چنین رشد گسترده‌ای را می‌توان به توانایی این روش در جداسازی طیف وسیعی از مواد با نقطه جوش بالا و موادی که در اثر حرارت تجزیه می‌شوند، اندازه‌گیری‌های کمّی و صحیح، حساسیت، توانایی در جداسازی سریع مخلوط‌های پیچیده و کاربرد گسترده آن در زمینه موادی که از نظر صنعتی اهمیت دارند، نسبت داد. از میان موادی که به‌وسیله این روش مورد تجزیه قرار گرفته‌اند می‌توان به اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربن‌ها، کربوهیدرات‌ها، داروها، استروئیدها، آنتی‌بیوتیک‌ها و … اشاره نمود.

 بیشتر بدانید:شیشه الات ازمایشگاهی

تجهیزات کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

به‌طور خلاصه و ساده می‌توان گفت:‌

جریانی از یک حلال به نام فاز متحرک،‌ از درون یک ستونِ پر شده به نام فاز ساکن عبور می‌کند و نمونه آزمایش از قسمت تزریق وارد ستون شده و اجزاء نمونه بر اساس ماهیت شیمیایی با فاصله زمانی متفاوتی از ستون شسته می‌شوند، سپس به‌وسیله آشکارساز شناسایی شده و نتایج به‌صورت پیک‌هایی به ثبت می‌رسد.

دستگاه HPLC، می‌تواند مجموعه‌ای از مدول‌ها یا اجزای سازنده جداگانه باشد، این در حالیست که می‌تواند به‌صورت یک دستگاه تک نیز طراحی شود. مفهوم مدول در مورد خرابی یک جزء سازنده‌ی تک، انعطاف‌پذیر است، به‌علاوه لزومی ندارد که قطعه‌های تک همه از یک سازنده‌ی دستگاه باشند. در صورتی که تمایل نداشته باشید خود تعمیرات جزئی را انجام دهید بهتر است یک دستگاه جمع‌وجور یکپارچه خریداری کنید. به‌هرحال این دستگاه فضایی کمتر از یک مجموعه مدولی را اشغال نخواهد کرد.

دستگاه HPLC شامل حداقل اجزای سازنده‌ای است که در شکل ۱ نشان داده شده‌اند:

شکل ۱. نمودار شمایی یک واحد HPLC

۱= مخزن حلال، ۲= خط انتقال با چینی متخلخل، ۳= پمپ (با فشارسنج)، ۴= تزریق نمونه،

۵= ستون (با دماپا)، ۶= آشکارساز، ۷= فاضلاب، ۸= کسب داده‌ها

 

مخزن حلال، خط انتقال با چینی متخلخل، پمپ با فشار زیاد، وسیله تزریق نمونه، ستون، آشکارساز و ثبات داده‌ها معمولاً همراه با ارزیابی داده‌ها. گرچه ستون مهم‌ترین قسمت است، ولی معمولاً کوچک‌ترین قطعه است. برای جداسازی‌های هم‌دما، ستون معمولاً در یک دماپا محبوس شده است. کاملاً متداول است بیش از یک حلال بکار بریم، بنابراین به یک مخلوط‌کن و کنترل‌کننده نیاز است. در صورتی که کسب داده‌ها با یک کامپیوتر انجام شود، آن‌را می‌توان برای کنترل کل سیستم نیز بکار گرفت.

هر قسمتی از سیستم که در تماس با فاز متحرک است باید از موادی ساخته شود که به‌وسیله حلال‌های مورد استفاده آسیب نبیند. قسمت‌هایی که در تماس با حلال هستند معمولاً از فولاد ضدزنــــــــــگ یا پلی‌‌ تترافلوئورواتیلن یا مواد دیگر مانند یاقوت کبود یا سرامیک ساخته شده‌اند، همچنین قسمت‌هایی نظیر خروجی پمپ تا انتهای ستون که معمولاً در معرض ایجاد فشار قوی قرار می‌گیرند باید آنقدر محکم باشند که تحمل فشار را داشته باشند. نکته مهم دیگر در طراحی دستگاه‌های HPLC این است که بین تزریق جسم و آشکار کردن آن باید حجم مرده به کمترین حد خود برسد. منظور از حجم مرده فضاهای خالی یا اشغال نشده می‌باشد. وجود حجم مرده زیاد سبب از دست دادن شدید کارایی سیستم می‌گردد. واضح است که ستون نیز در جاهایی که توسط فاز ساکن پر نشده دارای مقدار کمی حجم مرده است.

 

• مخازن فاز متحرك و سيستم‌هاي مورد عمل قرار دادن حلال

يك دستگاه جديد HPLC به يك و يا تعداد بيشتري مخزن شيشه‌اي و يا فولاد زنگ‌نزن مجهز است كه حاوي ۵۰۰ میلی‌لیتر و يا بيشتر از حلال است. مخازن اغلب به وسايلي براي حذف گازهاي حل شده (معمولاً اكسيژن و نيتروژن) مجهزند. این گازها با تشكيل حباب‌ها سبب پهن شدن نوار پيك‌ها مي‌شوند و علاوه بر اين، اغلب با عملكرد آشكارساز تداخل مي‌كنند. گاززداها ممكن است به يك سيستم پمپ خلأ، يك سيستم تقطير، وسايلي براي گرم كردن و هم زدن حلال و همچنین به سيستم‌هايي براي وارد كردن و پاشيدن حباب‌هاي يك گاز بي‌اثر براي خارج كردن گازهاي حل شده از محلول، مجهز ‌باشند.

همچنين اغلب اوقات سيستم وسيله‌اي براي صاف كردن گردوغبار ذرات از حلال دارد تا از آسيب ديدن پمپ يا وسيله‌ي تزريق يا گرفتگي ستون به‌وسیله‌ي اين ذرات جلوگيري شود. لزومي ندارد كه گاززداها و صافي‌ها، جزء لاينفك دستگاه HPLC باشند. مثلاً، يك راه مناسب، آماده‌سازی حلال‌ها قبل از هدايت آنها به مخزن، صاف كردن حلال از داخل يك صافي ريزمنفذ در خلأ است. اين آماده‌سازی، گازها و همچنين مواد معلق را حذف مي‌كند.

 

• سیستم‌های پمپ‌کننده

وظیفه اصلی پمپ در HPLC این است که فاز متحرک را با فشار بالا و با سرعت عبور کنترل شده، از ستون عبور دهد. یک نوع پمپ (پمپ با فشار ثابت)، این عمل را با وارد آوردن فشار ثابت به فاز متحرک انجام می‌دهد و سرعت عبور از ستون با توجه به مقاومت ستون در برابر عبور جریان و مقاومت‌های دیگر موجود بین پمپ و آشکارساز تعیین می‌شود. نوع دیگر (پمپ با جریان ثابت)، این کار را با عبور جریان در حد خواسته شده انجام می‌دهد و در اینجا میزان فشار با توجه به مقاومت در برابر عبور تنظیم می‌گردد.

ممکن است مقاومت در برابر عبور در یک سیستم،‌ با زمان تغییر کند. این کار با ورم کردن یا نشت انباشته‌های ستون، تغییر درجه حرارت و یا تجمع ذرات خارجی موجود در نمونه، در پمپ و یا در واحد تزریق امکان‌پذیر است. اگر پمپی با فشار ثابت مورد استفاده قرار گیرد، به هنگام تغییر مقاومت در برابر عبور، سرعت عبور نیز تغییر خواهد کرد؛ اما در پمپ با جریان ثابت، تغییر مقاومت در برابر عبور، توسط تغییر فشار جبران می‌شود. تغییر در سرعت عبور سبب از دست دادن دقت و ایجاد خطوط پایه در دستگاه ثبات می‌شود.

علاوه بر اینکه پمپ باید قادر باشد تا فاز متحرک را در فشار بالا و با سرعت عبور یکنواخت از ستون عبور دهد، باید دارای خصوصیات زیر نیز باشد:

1. قسمت‌های داخلی پمپ که در تماس با حلال‌ها هستند نباید به‌وسیله حلال‌های مورد استفاده آسیب‌دیده و فاسد شوند.
2. پمپ باید قادر باشد تا گستره‌ای از سرعت عبور را فراهم آورد و ایجاد تغییر در سرعت عبور باید آسان باشد.
3. عبور حلال باید بدون ضربان باشد.
4. حجم درونی پمپ کم باشد تا تغییر فاز متحرک از یک نوع به نوع دیگر به‌آسانی امکان‌پذیر شود.
5. پمپ باید به‌گونه‌ای باشد که تعمیر و جدا کردن آن از سیستم به‌آسانی میسر باشد.

لازم به ذکر است که فشار بالا به خودی خود چیزی نیست که در HPLC به دنبال آن هستیم. واقعیت این است که فاز متحرک، یک مایع است که برای عبور آن از درون یک بستر پرشده متراکم به فشار بالایی نیاز است. ذرات کوچک مسیرهای نفوذ کوتاهی دارند و بنابراین تعداد زیادی از بشقابک‌های نظری در واحد طول در اختیار می‌گذارند. در تئوری بشقابک‌های فرضی یا نظری (Plates) فرض می‌شود که هر ستون از یک سری لایه‌های باریک، افقی و کاملاً مجزا از هم که به‌طور متوالی قرار گرفته‌اند، تشکیل شده است.

به هر یک از این لایه‌ها، بشقابک گفته می‌شود. در هرکدام از این بشقابک‌ها، آنالیت یا ماده‌ی مورد تجزیه در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد و در نهایت با انتقال بین بشقابک‌ها عمل جداسازی صورت می‌پذیرد. کارایی هر ستون به تعداد بشقابک‌های موجود در ستون و یا به عبارت دیگر، به تعداد تعادل‌های ایجاد شده در ستون بستگی دارد؛ بنابراین برای بررسی کارایی ستون، تعداد بشقابک‌های فرضی (N) را از رابطه زیر محاسبه می‌کنند. در این رابطه H نشان‌دهنده ارتفاع هر بشقابک و L طول ستون را به نمایش می‌گذارد.

• پمپ‌های با فشار ثابت

در اولین نوع پمپ‌های با فشار ثابت در HPLC (پمپ‌های حلقوی)،‌ گاز متراکم درون سیلندر با فشار زیاد فاز متحرک موجود در مسیر اتصال (بین مخزن حلال و ورودی ستون) را به درون ستون می‌راند. این نوع پمپ در انواع قدیمی HPLC استفاده می‌شد و هم‌اکنون تنها از جنبه تاریخی جالب است. پمپ‌های بادی از جمله پمپ‌های با فشار ثابت می‌باشند. اصول عملکرد پمپ‌های بادی تشدیدکننده در شکل ۲ زیر نشان داده شده است.

شکل ۲. پمپ بادی تشدیدکننده

 

• پمپ‌های با جریان ثابت

در ‌HPLC دو نوع پمپ با جریان ثابت مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در پمپ سرنگی (شکل ۳)،‌ فاز متحرک توسط یک اتاقک از یک موتور جدا می‌شود. این موتور با سرعت متفاوت پیچی را گردانده که آن نیز سبب گردش پیستون می‌شود. جریان در اینجا بدون نبض- Pulse است و می‌تواند با تغییر سرعت موتور تغییر پیدا کند. اتاقک در حدود ۲۰۰ تا ۵۰۰ سانتیمتر مکعب حجم دارد و ظرفیت فاز متحرک محدود به ظرفیت اتاقک است. اگرچه میزان حجم اتاقک زیاد است و قبل از پر کردن مجدد آن، تعداد زیادی نوار جذبی کروماتوگرافی می‌توان بدست آورد، اما زمانی که تغییر حلال لازم است برای خارج کردن آن از اتاقک، میزان زیادی حلال از بین می‌رود.

شکل ۳. پمپ سرنگی

 

نوع دیگر پمپ که در دستگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد، پمپ متناوب می‌باشد که در شکل ۴ نشان داده شده است.

با استفاده از دنده یا گیره‌ی مختلف‌المرکز، پیستون به درون اتاقک حلال رفته و برمی‌گردد. در حرکت پیش‌برنده، شیر یک‌طرفه‌ی ورودی بسته شده و شیر یک‌طرفه خروجی باز می‌باشد لذا فاز متحرک به درون ستون می‌رود. در حرکت به عقب، شیر یک‌طرفه خروجی بسته و شیر‌ یک‌طرفه‌ی ورودی باز می‌شود تا اتاقک پر از حلال گردد. پمپ‌های متناوب برخلاف پمپ‌های سرنگی دارای ظرفیت نامحدود می‌باشند و حجم داخلی آنها می‌تواند خیلی کوچک باشد. سرعت جریان می‌تواند با تغییر طول پیستون و یا سرعت موتور تغییر کند و دسترسی به شیرها و مهره‌ها در این پمپ‌ها ساده می‌باشد.

در پمپ‌های متناوب یک‌دهانه‌ای (همانند شکل ۴) در ازای یک نیم‌دایره پمپ، فاز متحرک به درون ستون پمپاژ می‌شود و در ازای نیم‌دایره دیگر، اتاقک حلال پر می‌شود؛ بنابراین سرعت جریان همواره ثابت نیست؛ اما با استفاده از پمپ‌های متناوب دودهانه که دو دهانه با اختلاف فازِ برابر با ۱۸۰ درجه کار می‌کنند، زمانی که یک دهانه، حلال را به درون ستون می‌برد، دهانه دیگر در حال پر کردن اتاقک حلال خود می‌باشد، در نتیجه عملکرد دودهانه‌ای که ۱۸۰ درجه اختلاف فاز دارند سبب جریان بدون نبض می‌شود.

شکل ۴. پمپ متناوب

 

• پمپ‌های پیستونی

این پمپ‌ها معمولاً از یک محفظه کوچک تشکیل شده‌اند که در آن حلال با حرکت رفت و برگشت یک پیستون توسط موتور پمپ می‌شود. دو شیر یک‌طرفه که به‌طور متناوب باز بسته می‌شوند، جریان حلال به داخل و به خارج از سیلندر را کنترل می‌کنند. حلال در تماس مستقیم با پیستون است یا اینکه ممکن است فشار از طریق یک دیافراگم انعطاف‌پذیر که خود نیز توسط یک پیستون رفت و برگشتی به طریق هیدرولیکی پمپ می‌شود، به حلال منتقل شود. از مزیت‌های پمپ‌های پیستونی می‌توان به حجم داخلی کوچک، فشارهای خروجی زیاد (تا 10000 psi) و سرعت جریان‌های ثابت اشاره کرد.

به‌طور کلی نيازمندي‌هاي مهم براي يك سيستم ‌پمپ‌كننده‌ي HPLC عبارتند از:

1. تولید فشارهای تا 6000 psi
2. خروجي بدون نبض یا ضربان- pulse
3. سرعت جریان در گستره‌ی 0/1 تا 10 (ml/min)
4. اجزاي سازنده‌ي مقاوم در مقابل خوردگي

 

• سیستم تزریق نمونه

متداول‌ترین روش وارد کردن نمونه در کروماتوگرافی مایع که به‌طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد، توسط حلقه‌های نمونه‌بردار- loop/valve injector است. این وسایل اغلب از قسمت‌های اصلی دستگاه‌های HPLCاند و قابلیت تعویض‌پذیری دارند که انتخاب اندازه‌های نمونه از ۵ تا ۵۰۰ میکرولیتر را فراهم می‌آورند. این وسیله به‌منظور نگهداری و سپس ورود مقدار مشخصی از نمونه به درون فاز متحرک طراحی شده است. نمونه معمولاً توسط سرنگ و به‌صورت دستی و یا به‌صورت اتوماتیک از درون ویال‌ها به درون حلقه این وسیله وارد می‌شود. زمانی که لازم است تا تزریق صورت پذیرد، یک سوئیچ چرخشی حرکت می‌کند و جریان از درون حلقه حاوی نمونه عبور می‌کند.

 

• ستون‌ و پیش‌ستون

ستون‌ها قلب کروماتوگرافی هستند و موفقیت یا عدم موفقیت یک آنالیز بستگی به انتخاب ستون دارد. جنس ستون‌ها معمولاً از فولاد ضدزنگ می‌باشد که با ماده پرکننده ستون پر شده است. این ماده پرکننده دو نوع می‌باشد:

1. مواد غیرآلی سرامیکی مانند سیلیکا و آلومینا که دارای استحکام بالایی می‌باشند و در هر حلالی حل نمی‌شوند.
2. پلیمرهای آلی که دو نوعِ پلی استایرن دی‌وینیل بنزن و همچنین متاکریلیت‌ها می‌باشند که نسبت به مواد غیرآلی استحکام کمتری دارند و زودتر فشرده می‌شوند، ضمن اینکه حلال‌ها با نفوذ در ماتریس پلیمری آنها باعث حل شدن (خوردگی) ذرات می‌شوند که نتیجتاً باعث پایین آمدن کارایی ستون با کاهش سرعت انتقال آنها می‌شود.

طول اکثر ستون‌های کروماتوگرافی مایع ‍۱۰ تا ۳۰ سانتی‌متر است. معمولاً ستون‌ها مستقیم‌اند و هر زمان که به طول‌های بیشتری احتیاج باشد، با متصل کردن دو یا چند ستون به یکدیگر، این کار انجام می‌شود. قطر داخلی ستون‌های مایع اغلب ۴ تا ۱۰ میلی‌متر است. متداول‌ترین اندازه ذرات پرکننده‌ها ۵ و ۱۰ میکرومتر است. بطورکلی می‌توان گفت که نام ستون‌ها بنا بر کارخانه سازنده، مختلف می‌باشد وگرنه همگی دارای خواص کاربردی تقریباً یکسانی هستند. در زیر چند گروه از ستون‌ها نام برده شده است:

• ستون‌هایی که زنجیره‌هایی با ۸ کربن دارند (C_۸)
• ستون‌هایی که زنجیره‌هایی با ۱۸ کربن دارند (C_۱۸)
• ستون‌های سیلیکائی (SI)
• ستون‌های با گروه آمینی (NH_۲-)
• ستون‌هایی با گروه سیانو (CN-)
• ستون‌هایی با گروه فنیلی (PHENYL)
• ستون‌هایی با گروه دی‌الی (OH-)

اغلب، یک ستون کوتاه محافظ (پیش‌ستون) قبل از ستون تجزیه‌ای به کار می‌رود. این کار عمر ستون تجزیه‌ای را افزایش می‌دهد.

 

• دماپای ستون

براي بسياري از كاربردها، كنترل دقيق دماي ستون لازم نيست و ستون را مي‌توان در دماي محيط بكاربرد. با وجود اين، اغلب اوقات، با ثابت نگهداشتن دماي ستون تا چند دهم درجه سانتيگراد، كروماتوگرافي بهتري بدست مي‌آيد. اكثر دستگا‌ه‌هاي تجاري جديد امروزه به گرم‌كننده‌هاي ستوني مجهزند كه دماي ستون را تا چند دهم درجه از نزديك دماي محيط تا ۱۰۰ الی ۱۵۰ درجه سانتی‌گراد كنترل مي‌كنند.

 

• آشکارسازها

عامل وجودی آشکارساز در HPLC، آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می‌‌آید؛ بنابراین، آشکارساز باید تغییر در ترکیب فاز متحرک را به طریقی نظارت و پایش و به یک علامت الکتریکی تبدیل کند. خروجی آشکارساز این علائم الکتریکی است که با خصوصیات فاز متحرک یا جزء نمونه متناسب است، سپس این علامت به ثبات یا صفحه نمایش انتقال می‌یابد که در آنجا به‌صورت انحرافی از خط مبنا نشان داده می‌شود. یک آشکارساز ایده‌ال باید مشخصات زیر را داشته باشد:

• حساسیت کافی
• پایداری خوب و تکرارپذیری
• زمان عکس‌العمل کوتاه که مستقل از سرعت جریان است
• قابلیت اعتماد بالا و سهولت کار
• حجم مرده- Dead Volume پایین
• حد تشخیص پایین (یعنی قادر باشد مقادیر کوچک نمونه را نظارت کند)
• ارزان قیمت و دستکاری آن ساده باشد

به‌ندرت می‌توان آشکارسازی یافت که تمام موارد فوق را دارا باشد و می‌توان گفت که خصلت‌ها یا ویژگی‌های مختلف یک آشکارساز بر یکدیگر تأثیر می‌گذارند.

 

انواع آشکارسازها در HPLC به قرار زیرند:

• آشکارسازهای جاذب ماوراء بنفش-UV
• آشکارسازهای ضریب شکست
• آشکارسازهای فلوئورسانی
• آشکارسازهای الکتروشیمیایی
• آشکارسازهای پراکندگی نور
• آشکارسازهای رسانندگی
• آشکارسازهای زیرقرمز (IR)
• آشکارسازهای پرتوزایی

در این میان، آشکارسازهای جذب UV، عمومی‌ترین آشکارساز HPLC بشمار می‌روند؛ زیرا می‌توانند نسبتاً حساس باشند، گستره‌ی خطی وسیعی دارند و تا حد زیادی تحت تأثیر افت‌وخیزهای دما قرار نمی‌گیرند. اصول کارکرد این آشکارسازها بر این مبنا است که فاز متحرک از ستون به درون محفظه‌ای کوچک جاری می‌شود، محفظه در مقابل اشعه فرابنفش/ مرئی منتشرشده از دستگاه نورسنج یا طیف‌سنج قرار می‌گیرد. این آشکارسازها انتخابگر بوده و فقط می‌توانند اجزاء نمونه‌ای که نور فرابنفش یا مرئي را جذب می‌کنند، آشکار سازند؛ یعنی در صورتی که ملکول دارای حداقل یکی از موارد زیر باشد، جذب در طول‌موج بالای ۲۰۰ نانومتر صورت می‌گیرد.

• برم، ید یا گوگرد
• یک گروه کربونیل C=O یا گروه نیترو NO_۲
• دو پیوند دوگانه مزدوج X=X-X=X
• یک حلقه آروماتیک
• یون‌های معدنی شامل: ^–Br^–،I^–، NO_۳^–، NO_۲

به‌طور کلی آشکارسازهای جذب UV فقط در برخی مواد همچون آلکان‌ها، ترکیبات آروماتیک و ترکیبات دارای پیوند چندگانه که در داخل فاز متحرک جاذب نور ماوراء بنفش می‌باشند، انتخابی عمل می‌کنند.

آشکارسازهای ضریب شکست این مزیت مهم را دارند که نسبت به تمام مواد حل شده جواب می‌دهند. علاوه براین، این آشکارسازها اعتماد پذیرند و سرعت جریان بر آنها اثری ندارد. ضمن اینکه این آشکارسازها خیلی حساس به حرارت هستند.

امتیاز ذاتی آشکارسازهای فلوئورسانی حساسیت بالای آنهاست که نوعاً ده مرتبه یا بیشتر، بزرگ‌تر از آشکارسازهای جاذب ماوراء بنفش است. بااین‌حال این آشکارسازها نسبت به دیگر آشکارسازها کم مورد استفاده قرار می‌گیرند چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند، زیاد نیستند.

 

• پردازشگر سیگنال

پردازشگرها شامل یک سیستم کامپیوتری می‌باشند که سیگنال‌های حاصل از آشکارساز را به شکلی که برای کاربر قابل استفاده باشد، تبدیل می‌کنند که حاصل این تبدیل به‌صورت کروماتوگرام نمایش داده می‌شود که متشکل از یک یا چند پیک می‌باشد که مساحت زیر پیک و ارتفاع پیک متناسب با غلظت آنالیت است. از این مسئله (مساحت زیر پیک و ارتفاع پیک) برای آنالیز کمی و از شکل و زمان پیک نیز برای آنالیز کیفی استفاده می‌شود.

 

انواع روش‌های کروماتوگرافی HPLC

چهار نوع مکانیزم یا فرآیند برای بازداری مولکول‌های نمونه توسط فاز ساکن وجود دارد. این چهار فرآیند باعث ایجاد چهار روش اساسی در کروماتوگرافی مایع می‌شود:

• کروماتوگرافی تقسیمی

Partition chromatography

• کروماتوگرافی جذبی

Absorption chromatography

• کروماتوگرافی غربال ملکولی (ژلی)

Size exclusion chromatography

• کروماتوگرافی تبادل یونی

Ion exchange chromatography

كروماتوگرافي تقسيمي در بين چهار روش فوق، بيشتر از همه بكار برده شده است. این روش شامل فاز ساکن می‌شود که نوع ترکیب آن، از فاز مایع در حال حرکت متفاوت است. مولکول‌های نمونه مورد آزمایش در این روش بین فازهای ساکن و متحرک توزیع می‌گردند. ضمن اینکه فاز ساکن و متحرک نباید قابل امتزاج در یکدیگر باشند.

در کروماتوگرافی غربال ملکولی، جداسازي مبتني بر اَلَك كردن مولكولي بر روي اجسام بی‌بار در جريان مهاجرت الكترواسمزي از داخل ژل‌ها انجام مي‌شود، بدين ترتيب كه جداسازي بر مبناي اندازه‌هاي نسبي مولكول‌ها انجام شده و از اصطلاح صاف كردن به‌وسيله ژل استفاده مي‌شود. ژل استفاده شده در اين روش بايد بی‌اثر و پايدار باشد. فاز ساكن از يك قالب متخلخل تشكيل شده كه منفذهاي آن به‌وسيله حلالي كه فاز متحرك را تشكيل داده پر شده است. از آنجايي‌ كه اساس جداسازي بر اين مبناست كه مولکول‌های بزرگ‌تر از حد وارد سوراخ‌ها نشده و به ترتيب جرم مولكولي از ستون خارج شوند و مولكول‌هاي کوچک‌تر برحسب شدت نفوذشان سوراخ‌ها را پر كنند، پس اندازه سوراخ بسيار مهم است. از ديگر عوامل مهم حجم نمونه است، بدين ترتيب كه هر چه حجم نمونه كمتر باشد، غلظت هر جزء در محلول خارج‌شده نيز كمتر خواهد بود.

جهت جدا نمودن موادي كه داراي بار الكتريكي می‌باشند می‌توان از کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده نمود. در اين حالت، ستون كروماتوگرافي داراي ذراتي با بار مثبت و منفي مي‌باشد كه عناصر باردار، نمونه مورد نظر را جذب مي‌نمايند، لذا نمونه‌هایي كه خارج مي‌گردد، فاقد هرگونه ذرات باردار خواهد بود. ستون مي‌تواند داراي يون مثبت يا منفي و يا هر دوي آنها باشد.

 

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی